Анализ комплексов лактоферрина молока человека
Дипломная работа - Химия
Другие дипломы по предмету Химия
;
.
Для всех полученных в работе экспериментальных данных был проведен математический и статистический анализ. Статистическую обработку результатов проводили методом вариационной статистики с применением t-критерия Стьюдента для средних арифметических (результаты считали достоверными при Р < 0,05).
2.2.6Условия проведения экспериментов по анализу ЛФ методом абляции
В экспериментах по абляции использовались те же растворы, что и в описанных выше исследованиях ЛФ методом гель-хроматографии, МУРР и СР. Различные образцы ЛФ (50-100 мкл) наносили в центр квадратов диаметром 1,5-2 см, полученных из силуфольных пластинок. Растворы белка наносили либо на поверхность, покрытую селикагелем, либо на обратную сторону - алюминиевую поверхность. Алюминиевые и силуфольные подложки перед нанесением образцов охлаждали жидким азотом и затем образцы подвергали лиофилизации на стандартной установке. Абляцию вели при интенсивности потока от 5 до 30 Ватт/см2. Анализ результатов абляции проводили, как описано выше.
3.Результаты
Как указано выше, ЛФ образует комплекс с АТР и другими рибо- и дезоксирибонуклеозид-5- моно- ди и трифосфатами и гидролизует эти нуклеотиды [19, 23, 29]. Кроме того ЛФ взаимодействует с олиго- и полисахаридами и также гидролизует их [22-24, 27-26]. Согласно литературным данным ЛФ в растворе представлен преимущественно двумя формами - мономером и тетрамером [16]. Представлялось интересным исследовать не ведет ли комплексообразование ЛФ с его лигандами к изменению его олигомерного состояния и являются ли мономер и тетрамер действительно основными формами существования ЛФ в растворе или возможно образование промежуточных форм (димера и тримера), а также более высокоолигомерных форм, которые не возможно обнаружить с помощью использованных в литературе методов.
Для изучения олигомерных форм ЛФ необходимы были прямые методы анализа олигомерных форм белков в растворе. Известно, что использование дифракционных методов для анализа макромолекул и их комплексов позволяет получить информацию о их структуре и дисперсном составе непосредственно в растворе [, , ].
Для исследования олигомерного состояния ЛФ на первом этапе было использовано два подхода - метод малоуглового рассеяния рентгеновских лучей (МУРР) и светорассеяния (СР). Это определялось тем, что потенциально ЛФ мог находиться в различных олигомерных формах от мономера до высокополимерных состояний. В то же время, с помощью МУРР можно видеть только частицы относительно небольшого размера, характеризуемые параметром h = 0.013 0.103 -1, что сопоставимо в размером олигомеров ЛФ, содержащих от 1 до 4 мономерных единиц, этот метод "не видит" более крупных частиц. Наличие в растворе более крупных частиц с h = 0,00137 0.00206 -1 можно анализировать с помощью метода СР.
Обычно в экспериментах по исследованию ЛФ используются препараты белка, которые после очистки хранятся в нейтральных растворах с концентрацией порядка 2 - 10 мг/мл при 4oС или растворы белка замораживаются. Сначала нами были получены рентгенограммы МУРР для стандартного раствора лиофилизованного ЛФ (50 мМ Трис -НСl буфер, рН 7,5), хранившегося в течение месяца при 4оС (рис. 7).
Рис. 7. Рентгенограммы МУРР в координатах I(h) от h для одного из препаратов агрегированного ЛФ (68 мкМ) в 50 мМ Tрис-НCl буфере, рН 7.5, до и после инкубации с 1 M NaCl в течение 1 - 42 ч. Этим четырем кривым соответствуют значения Rg, равные: 43.7, 38.6, 32.9 и 27.4 , соответственно. Из данных МУРР следует что ЛФ переходит в мономерную форму при 1 М концентрации NaCl.
Данные для ЛФ были построены в координатах Гинье и на их основании рассчитано значение Rg. Согласно данным МУРР оно равно 43.7 , что значительно выше ожидаемого и свидетельствует в пользу того, что ЛФ находится в растворе не в моно, а в полидисперсном состоянии. Как известно, при добавлении 1 М NаСl олигомерные формы ЛФ должны диссоциировать до мономеров [16-17]. На рис. 7 приведены данные по изменению рентгенограмм МУРР во времени для раствора ЛФ после добавления NaCl до конечной концентрации 1 М. Из этих данных были оценены величины Rg для ЛФ через разные промежутки времени после добавления NаСl: 38.6 (через 1 ч); 32.9 (20 ч) и 27.4 , (42 ч). Как видно из рис. 7, кривая, соответствующие 42 ч инкубации совпадают с таковыми для ожидаемого мономера ЛФ с величиной Rg = 26.7 . Следовательно, диссоциация олигомерных форм ЛФ под действием соли происходит медленно, и только после 42 ч инкубации раствор содержит преимущественно мономерные формы белка.
Эти же растворы были проанализированы с помощью СР (подробнее смотри ниже). По данным СР растворы лиофилизованных препаратов ЛФ содержали олигомеры более высокой олигомеризации, чем тетрамеры, которые можно видеть с помощью МУРР.
Из данных полученных выше, было очевидным, что при длительном хранении растворов ЛФ происходит образование различных олигомерных форм белка. Для исследования эффектов различных лигандов на процессы олигомеризации необходимо было оценить временные интервалы, за которые происходит образование олигомеров в отсутствие и в присутствии различных лигандов ЛФ, а также КСl.
Как известно, ЛФ является исключительно конформационно активным белком [24]. Полученные данные свидетельствовали в пользу того, что в процессе лиофилизации молекулы белка могут переходить в какую-то конформацию, которая не способствует его олигомеризации с образованием форм с исключительно большой мол. массой. По-видимому, в процессе хранения ?/p>