С. П. Сапожников Е. М. Лузикова О. И. Московская Общая и медицинская генетика Учебное пособие

Вид материала

Учебное пособие

Содержание ГЛАВА 5. Методы исследования в генетике человека. Кариотип 5.2. Денверская классификация хромосом Группы хромосом и их характеристика 5.3. Парижская классификация хромосом Тестовые задания

Подобный материал:

• Темы: общая генетика, генетика человека, медицинская генетика. Вопросы для самоподготовки., 39.67kb.
• В. И. Александров Учебное пособие. Российская медицинская академия последиплом, 207.44kb.
• Н. А. Общая ботаника с основами геоботаники: Учебное пособие, 520.6kb.
• О. М. Мышалова общая технология мясной отрасли учебное пособие, 1355.07kb.
• Учебное пособие умо м., Медицинская книга 40 2000 Чадаев А. П. 2006, 776.08kb.
• Глинка Николай Леонидович. Общая химия: учебное пособие, 501.78kb.
• Эволюционная, популяционная и общая генетика. Положения, пересекающиеся с валеологией, 625.07kb.
• Учебное пособие Житомир 2001 удк 33: 007. Основы экономической кибернетики. Учебное, 3745.06kb.
• Учебное пособие, 2003 г. Учебное пособие разработано ведущим специалистом учебно-методического, 794.09kb.
• Учебное пособие, 2003 г. Учебное пособие разработано ведущим специалистом учебно-методического, 454.51kb.

ГЛАВА 5. Методы исследования в генетике человека. Кариотип

5.1. Строение хромосом и их морфология

При анализе метафазных пластинок в световом микроскопе можно различить, что любая хромосома состоит из двух плеч и центромеры, или первичной перетяжки, выполняющей функцию механического центра хромосомы при делении. Центромера является областью хромосомы, к которой при делении клетки прикрепляется нить веретена деления, разводящая хромосомы к полюсам клетки. Кроме первичной перетяжки некоторые хромосомы имеют вторичную перетяжку, не связанную с процессом прикрепления нитей веретена. Месторасположение вторичной перетяжки в хромосоме связано с образованием ядрышка, а этот участок хромосомы называют ядрышковым организатором. Длинное плечо хромосомы обозначается латинской буквой «q», короткое — «р».

Концевые участки хромосом имеют сегменты, препятствующие склеиванию хромосом своими концами, и тем самым способствуют сохранению их целостности. Эти сегменты были названы теломерами.

Если центромера расположена в центре хромосомы и как бы делит ее на равные части, то такая хромосома носит название равноплечной, или метацентрической. Если одно плечо незначительно больше другого — субметацентрической. Хромосому с почти терминальным (концевым) положением центромеры, когда одно плечо значительно больше другого, называют акроцентрической. Некоторые акроцентрические хромосомы имеют так называемые спутники — участки, соединенные с остальной частью хромосомы тонкой нитью хроматина. Такие хромосомы называют спутничковыми. Размер спутника относительно длины всей хромосомы постоянен для каждой конкретной хромосомы. В кариотипе человека спутники имеются у пяти пар хромосом: у 13-й, 14, 15, 21 и 22-й.


5.2. Денверская классификация хромосом

Классификация и номенклатура равномерно окрашенных хромосом человека впервые были приняты на международном совещании в 1960 году в г. Денвере, в дальнейшем несколько измененные и дополненные (Лондон, 1963 и Чикаго, 1966). Согласно Денверовской классификации все хромосомы человека разделены на 7 групп, расположенных в порядке уменьшения их длины и с учетом центриольного индекса (отношение длины короткого плеча к длине всей хромосомы, выраженное в процентах). Группы обозначаются буквами английского алфавита от А до G. Все пары хромосом принято нумеровать арабскими цифрами. Характеристика групп представлена в табл. 4.

Предложенная классификация позволяла четко различать хромосомы, принадлежащие к различным группам. С 1960 года начинается бурное развитие клинической цитогенетики: в 1959 году Дж. Лежен открыл хромосомную природу синдрома Дауна; К. Форд, П. Джекобс и Дж. Стронг описали особенности кариотипа при синдромах Клайнфельтера и Тернера; в начале 70-х гг. была открыта хромосомная природа синдромов Эдвардса, Патау, синдрома «кошачьего крика»; описана хромосомная нестабильность при ряде наследственных синдромов и злокачественных заболеваниях. Вместе с тем применение метода получения равномерно окрашенных хромосом оказалось недостаточно эффективным для идентификации хромосом. Недостатком денверской классификации является то, что разграничение гомологичных пар внутри группы хромосом встречает зачастую непреодолимые трудности.


Таблица 4

Группы хромосом и их характеристика

Группа	№ хромосомы	Расположение центромеры	Центриольный индекс (%)	Примечание
А	1	Самая большая метацентрическая	48-49	На длинном плече может быть вторичная перетяжка
	2	Самая большая субметацентрическая	38-40
	3	Большая метацентрическая	45-46	На 20% короче первой
В	4,5	Большая субметацентрическая	24-30
С	6-12 и Х-хромосома	Средние субметацентрические	27-35	На 9-ой часто вторичная перетяжка
D	13-15	Средние акроцентрические	≈15	На всех вторичные перетяжки
Е	16	Маленькая метацентрическая	40	В 10% случаев встречается вторичная перетяжка
	17	Маленькая субметацентрическая	34
	18	Маленькая субметацентрическая	26
F	19-20	Самые маленькие метацентрические	36-46
G	21-22 и Y-хромосома	Самые маленькие акроцентрические	13-33	На 21-й и 22-й вторичные перетяжки

5.3. Парижская классификация хромосом

В настоящее время используются дифференциальные методы окрашивания метафазных хромосом с избирательным выявлением их отдельных фрагментов. Топография окрашиваемых участков по длине хромосомы зависит от локализации определенных фракций ДНК, например сателлитной, распределения участков структурного гетерохроматина и ряда других факторов.

Применяют 4 основных метода дифференциальной окраски: Q, G, R и С. Все они выявляют закономерную линейную неоднородность фрагментов по длине метафазных хромосом. Характер окрашивания специфичен для каждой негомологичной хромосомы, что дает их точную идентификацию (рис. 19). Постоянство локализации окрашиваемых фрагментов позволяет составить «химические» карты хромосом. Сопоставление этих карт с генетическими используется для расшифровки функционально-генетических особенностей различных районов хромосом.

На основе избирательной окраски в 1971 году в Париже были разработаны карты линейной дифференцированности хромосом человека и предложена система их обозначения. Латинскими буквами р и q обозначаются соответственно короткое и длинное плечо хромосомы. От центромеры к теломере по имеющимся отчетливым морфологическим указателям (маркерам) в каждом плече выделяют районы, обозначаемые арабскими цифрами. В пределах районов идентифицируют сегменты — регулярные участки, отличающиеся по интенсификации окраски. Они также обозначаются арабскими цифрами. Так, символ 1р22 означает 2-й сегмент 2-го района короткого плеча хромосомы 1. Так для Х-хромосомы человека известны 96 локусов, некоторые из которых картированы. Имеются «пучки» сцепленных генов, концентрирующихся вокруг локусов цветовой слепоты, группы крови Xq и др. (рис.19).

Клинико-генеалогический метод был предложен в 1883 году Ф. Гальтоном. Он основан на построении родословных и прослеживании в ряду поколений передачи определенного признака. Метод позволяет установить:

1. является ли данный признак наследственным (по проявлению его у родственников);
   
2. тип и характер наследования (доминантный или рецессивный, аутосомный или гоносомный);
   
3. зиготность лиц родословной (гомо- или гетерозиготы);
   
4. пенетрантность гена (частота его проявления);
   
5. вероятность рождения ребенка с наследственной патологией (генетический риск).
   

Этапы генеалогического анализа:

1. 
   Сбор данных обо всех родственниках обследуемого по линии матери и отца на протяжении не менее трех поколений (анамнез или легенда).
   
2. Построение родословной.
   
3. Анализ родословной и выводы.
   

Д


Рис. 19 Схематическое изображение расположения локусов в хромосомах человека при их дифференциальной окраске. Дифференциальная окраска позволяет построить цитологические карты «групп сцепления» с точной локализацией генов и их комплексов.
ля построения родословных применяют условные обозначения, предложенные в 1932 году А. Юстом (рис. 20). Лицо, с которого начинается составление родословной называется пробандом, помечается знаком . Братьев и сестер пробанда называют сибсами. Поколения нумеруются сверху вниз римскими цифрами, начиная с I у вершины родословной. В пределах каждого поколения индивидуумы номеруются слева направо арабскими цифрами. Одновременно с родословной составляется письменное приложение к ней, называемое «легендой родословной». В легенде вписываются все сведения, которые могут оказаться полезными при анализе родословной, и заключения, вытекающие из ее изучения.

	- мужчина		- умер до года
	- женщина		- брак
	- имеющий данный признак		- родственный брак
	- пол неизвестен		- двойной брак
	- выкидыш		- сибсы (братья и сестры)
	- аборт и мертворождение		- однояйцевые близнецы
	- гетерозиготный носитель рецессивного гена		- разнояйцевые близнецы
	- носительница признака, сцепленного с X-хромосомой

Рис. 20. Символы, применяемые при составлении родословных


При анализе родословных следует учитывать ряд особенностей разных типов наследования признаков.

Аутосомно-доминантное наследование: больные в каждом поколении; больной ребенок у больных родителей; болеют в равной степени мужчины и женщины; проявление признака наблюдается в вертикальной и горизонтальной частях родословной; редкий признак наследуется половиной детей (неполная пенетрантность, низкая экспрессивность).

Аутосомно-рецессивное наследование: больные не в каждом поколении; больной ребенок рождается у здоровых родителей; болеют в равной степени мужчины и женщины; наследование признака идет преимущественно по горизонтали.

X-сцепленное доминантное наследование: больные в каждом поколении; женщины наследуют признак чаще, чем мужчины; если мать больна, а отец здоров, то признак передается потомству независимо от пола; если мать здорова, а отец болен, то у всех дочерей признак будет проявляться.

X-сцепленное рецессивное наследование: больные не в каждом поколении; больной ребенок рождается у здоровых родителей; болеют преимущественно мужчины; девочки наследуют признак от отца; наследование признака идет преимущественно по горизонтали.

Голандрическое наследование (Y-сцепленное): больные во всех поколениях; болеют только мужчины; у больного отца больны все его сыновья.

Цитоплазматической наследственностью называется наследование признаков и свойств организма, определяемое генами, локализованными вне ядра клетки. Совокупность наследственных задатков цитоплазмы называют плазмогеном, а сами задатки – плазмагенами. Плазмагены делятся на две группы:

1. 
   Гены ДНК-содержащих органелл клетки (пластиды, митохондрии).
   
2. Инфекционные агенты или симбионты клетки (вирусы, плазмиды).
   

Гены митохондрий называют хондриогенами, гены пластид – пластогены. Цитоплазматическая наследственность имеет следующие особенности:

1. признаки и свойства, определяемые генами цитоплазмы, наследуются только по материнской линии и всеми детьми независимо от пола;
   
2. органоиды цитоплазмы распределяются между дочерними клетками неравномерно, поэтому расщепление в F2 не подчиняется законам Менделя;
   
3. число органоидов цитоплазмы, определяющих степень развития признака, непостоянно, что влияет на характер проявления этих признаков у гибридов;
   
4. как правило, плазмагены контролируют развитие признака, взаимодействуя с генами хромосом, контролирующих тот же признак.
   

Митохондрии клеток человека имеют собственную ДНК (мтДНК) и автономную систему биосинтеза белков-ферментов, участвующих в процессах окислительного фосфорилирования. Мутационные изменения структурных генов мтДНК часто приводят к тем или иным нарушениям энергетического обмена в клетках. Такие нарушения лежат в основе патологических состояний, называемых митохондриальными болезнями человека. Примерами митохондриальных болезней являются хроническая прогрессирующая наружная офтальмоплегия; синдром Пирсона, проявляющийся нарушениями функций костного мозга, поджелудчной железы; атрофия зрительного нерва Лебера, приводящая к слепоте в возрасте до 20 лет; митохондриальная миоэнцефалопатия, синдром Лея, болезнь Кериса-Ситре и др.

Близнецовый метод изучения генетики человека введен в медицинскую практику Ф. Гальтоном в 1876 году. Он позволяет определить роль генотипа и среды в проявлении признаков. Различают моно- и дизиготных близнецов. Монозиготные (однояйцевые) близнецы развиваются из одной оплодотворенной яйцеклетки и имеют одинаковый генотип, но могут отличаться по фенотипу, что обусловлено воздействием факторов внешней среды. Дизиготные (двуяйцевые) близнецы развиваются после оплодотворения сперматозоидами нескольких яйцеклеток и имеют разный генотип.

Популяционно-статистический метод изучения генетики человека основан на использовании закона Харди - Вайнберга и позволяет определить частоту генов и генотипов в популяциях людей.

Цитогенетический метод основан на микроскопическом исследовании кариотипа клеток организма и выявлении геномных и хромосомных мутаций.

Биохимические методы основаны на изучении активности ферментных систем либо по активности самого фермента, либо по количеству конечных продуктов реакции, катализируемой данным ферментом. Применяют хроматографические, флюорометрические, радиоиммунологические и некоторые другие методы. Они позволяют выявлять генные мутации – причины болезней обмена веществ (например, фенилкетонурия, серповидно-клеточная анемия).

Методы рекомбинантной ДНК позволяют анализировать фрагменты ДНК, находить и изолировать отдельные гены и их сегменты, и устанавливать в них последовательность нуклеотидов.

Гибридизация соматических клеток дает возможность изучать многие вопросы генетики человека в эксперименте. Для культивирования чаще используют клетки соединительной ткани (фибробласты) и лимфоциты крови. На искусственных питательных средах можно осуществлять клонирование соматических клеток, селекцию клеток с заранее заданными свойствами и гибридизацию клеток.

Метод биологического моделирования применяется в основном для изучения мутагенного и тератогенного действия лекарственных препаратов перед их клиническими испытаниями, а также для решения вопросов генной инженерии.

Математическое моделирование – это метод создания и изучения математических моделей, применяемый для расчета частот генов в популяциях при различных воздействиях окружающей среды.

Экспресс-методы – это методы быстрой предварительной диагностики наследственных болезней человека. Они используются для обследования больших контингентов людей с целью выявления наследственной патологии и бывают следующими:

1. 
   Выявление X- и Y-хроматина чаще осуществляется посредством соскоба клеток слизистой оболочки щеки (буккальный эпителий).
   

Метод исследования полового хроматина: перед взятием соскоба пациента просят обкусать зубами слизистую оболочку щек и прополоскать рот. В случае, если имеют дело с пациентом, не выполняющим инструкции, ему протирают рот марлевой салфеткой. Эту процедуры необходимы для того, чтобы удалить отмирающие клетки, в которых половой хроматин не выявляется. При помощи специального шпателя с загнутым и слегка отточенным концом соскабливают эпителий слизистой оболочки. Беловатый налет круговыми движениями распределяют по поверхности чистого сухого предметного стекла, стараясь, чтобы клетки расположились ровным слоем.

На мазок наносят каплю ацеторсеина на 1-2 мин, затем накрывают препарат покровным стеклом, чтобы краска равномерно распределилась. Излишки краски удаляют фильтровальной бумагой. Окрашенный препарат изучают с помощью светого микроскопа с иммерсионным объективом. При этом половой хроматин выявляется под ядерной оболочкой клетки в виде плотного образования (тельца Барра) различной формы, чаще всего овальной или треугольной.

В норме половой хроматин обнаруживается в ядрах большинства клеток (50-70%) у лиц женского пола, тогда как у индивидуумов мужского пола он встречается очень редко (0-5% у всех клеток).

Метод определения полового хроматина позволяет одномоментно подвергнуть обследованию большие популяции. Однако он является ориентировочным и требует подтверждения, когда это возможно, анализом хромосом.

Для выявления Y-хроматина мазки окрашивают 0,005%-м раствором акрихин-иприта и просматривают под люминесцентным микроскопом: Y-хромосома дает яркое зеленое свечение. Этот метод позволяет установить количество Y-хромосом в кариотипе, оно равно количеству светящихся точек.

2. Дерматоглифический анализ – это изучение папиллярных узоров пальцев, ладоней и стоп. На этих участках кожи имеются крупные дермальные сосочки, а покрывающий их эпидермис образует гребни и борозды. Дерматоглифические узоры обладают высокой степенью индивидуальности и остаются в течение всей жизни, поэтому их используют для определения зиготности близнецов, для идентификации личности в криминалистике (дактилоскопия) и в качестве дополнительного метода для подтверждения диагноза хромосомных синдромов у людей с изменениями кариотипа.
   
3. Пренатальная диагностика – это комплексное исследование, основанное на применении инструментальных и лабораторных методов, включая ультразвуковое сканирование плода, изучение хориона и околоплодной жидкости.
   

Среди неинвазивных методов пренатальной диагностики получила широкое распространение ультразвуковая диагностика (УЗИ). В последнее время это исследование становится обязательным в процессе беременности. С помощью этого метода выявляются пороки развития конечностей, головного мозга и лицевого черепа, дефекты нервальной трубки, передней брюшной стенки, наличие у плода анэнцефалии, гидроцефалии, микроцефалии, пороки сердца и др.

К инвазивным методам относят амниоцентез, биопсию хориона, биопсию плаценты, кордоцентез, биопсию тканей плода.

Диагностический амниоцентез - один из методов, связанный с получением и изучением околоплодной жидкости. Амниоцентез представляет собой манипуляцию, которую проводят с согласия беременной женщины в клинике (оптимальным сроком проведения является 17-я неделя беременности). Чаще всего он состоит в том, что делают прокол передней брюшной стенки специальной иглой и получают 8-10 мл околоплодной жидкости. В этой жидкости имеются разнообразные клетки (клетки покровов плода, слизистой оболочки его ротовой полости, мочевыводящих путей, пуповины, амниотической оболочки). Общим с генетической точки зрения для всех этих клеток является то, что они происходят от плода и, следовательно, могут быть использованы для характеристики его кариотипа. Изучив состав полученной при амниоцентезе околоплодной жидкости, можно сделать заключение о тех или иных генетических особенностях плода.

Метод биопсии хориона основан на том, что хориальная ткань как производное трофобласта рано обособляется от эмриобласта, имея при этом генетическую конституцию плода. Трансцервикальная аспирация ворсин хориона получила название хорионцентеза. Клетки, полученные из ворсин хориона в ранние сроки беременности (8-12 недель), затем культивируют, проводят цитогенетическое исследование и изучают их ДНК.

Кордоцентез – это метод, связанный с получением крови из пуповины плода под контролем УЗИ и ее дальнейшим цитогенетическим, биохимическим, молекулярно-генетическим исследованием.

Тестовые задания

1. 
   Денверская классификация хромосом основывается:
   

1. на специфической окраске неоднородных фрагментов метафазной хромосомы;
   
2. на длине и расположении центромеры;
   
3. на количестве вторичных перетяжек;
   
4. на отношении короткого плеча к длинному.
   

2. В Денверской классификации хромосом к группе В относятся хромосомы:
   

1. большие субметацентрические;
   
2. самые большие метацентрические;
   
3. средние субметацентрические;
   
4. средние акроцентрические.
   

3. В Денверской классификации хромосом к группе D относят хромосомы с центриольным индексом, равным:
   

1. 48 – 49;
   
2. 38 – 40;
   
3. 45 – 46;
   
4. 15;
   
5. 26.
   

4. Центриольный индекс — это:
   

1. отношение длины короткого плеча к длине длинного плеча;
   
2. отношение длины короткого плеча к длине всей хромосомы;
   
3. отношение длины длинного плеча к короткому плечу.
   

4. Признак наследуется по доминантному Х-сцепленному типу, если:
   

1. встречается в каждом поколении у мужчин и женщин равноправно;
   
2. встречается в каждом поколении у мужчин и женщин, но отец-носитель признака передает его всем своим дочерям;
   
3. встречается не в каждом поколении, но у мужчин редко;
   
4. встречается не в каждом поколении как у мужчин, так и у женщин редко;
   
5. встречается у всех мужчин одного рода.
   

6. При составлении родословных родственный брак обозначается следующим символом:
   

1. ;
   

2. ;
   

3. ;
   

4. .
   

7. При составлении родословных однояйцевые близнецы обозначается следующим символом:
   

1. ;
   

2. ;
   

3. ;
   

4. .
   

8. Признак наследуется по доминантному Х-сцепленному типу, если:
   

1. встречается в каждом поколении у мужчин и женщин равноправно;
   
2. встречается в каждом поколении у мужчин и женщин, но отец-носитель признака передает его всем своим дочерям;
   
3. встречается не в каждом поколении, но у мужчин редко;
   
4. встречается не в каждом поколении как у мужчин, так и у женщин редко;
   
5. встречается у всех мужчин одного рода.
   

9. Близнецовый метод изучения генетики позволяет изучить:
   

1. активность ферментных систем (генные биохимические мутации);
   
2. частоту генов и генотипов в популяции людей;
   
3. роль генотипа и среды в проявлении признаков;
   
4. тип наследования гена;
   
5. мутагенное и тератогенное действие лекарственных препаратов.
   

10. Биохимический метод изучения генетики позволяет изучить:
    

1. активность ферментных систем (генные биохимические мутации);
   
2. частоту генов и генотипов в популяции людей;
   
3. роль генотипа и среды в проявлении признаков;
   
4. тип наследования гена;
   
5. мутагенное и тератогенное действие лекарственных препаратов.
   

11. К инвазионным методам пренатальной диагностики относят:
    

1. биопсию плаценты;
   
2. экспресс-методы;
   
3. популяционно-статистический метод;
   
4. биохимический метод;
   
5. амниоцентез.
   

11. Клинико-генеалогический метод был предложен:
    

1. А. Юстом;
   
2. Ф. Гальтоном;
   
3. К. Фордом;
   
4. П. Джекобсом;
   
5. Дж. Стронгом.
   

13. Цитологические карты «групп сцепления» с точной локализацией генов и их комплексов раскрывает:
    

1. Парижская классификация хромосом;
   
2. Денверская классификация хромосом;
   
3. классификация по длине плеч;
   
4. классификация по расположению центромеры.
   

14. Признак наследуется по голландрическому типу, если:
    

1. встречается в каждом поколении у мужчин и женщин равноправно;
   
2. встречается в каждом поколении у мужчин и женщин, но отец-носитель признака передает его всем своим дочерям;
   
3. встречается не в каждом поколении преимущественно у мужчин редко;
   
4. встречается не в каждом поколении как у мужчин, так и у женщин редко;
   
5. встречается у всех мужчин одного рода.
   

15. Кариотип – это:
    

1. совокупность генов в половых клетках;
   
2. совокупность генов одного организма;
   
3. совокупность генов популяции;
   
4. совокупность качественных и количественных признаков хромосом одного организма;
   
5. совокупность качественных и количественных признаков хромосом одного вида животных.