«Пермская государственная медицинская академия имени академика Е. А. Вагнера Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
| Вид материала | Автореферат |
- «Пермская государственная медицинская академия имени академии Е. А. Вагнера Федерального, 315.55kb.
- Язвах желудка и двенадцатиперстной кишки, 264.69kb.
- Язвах желудка и двенадцатиперстной кишки, 265.88kb.
- Оптимизация диагностики и хирургической тактики при экссудативном плеврите 14. 00., 254.78kb.
- Комплекс клинико-лабораторных симптомов и сопротивление дыхательных путей при рецидивирующем, 241.6kb.
- Скрябин владимир Леонидович новые углеродные материалы в реконструктивной хирургии, 418.36kb.
- Идиопатической тромбоцитопенической, 250.8kb.
- На правах рукописи, 721.93kb.
- Клинико-лабораторное обоснование диагностики бактериальных гнойных менингитов различной, 392.51kb.
- Оптимизация методов лечения хронических форм апикального периодонтита 14. 01. 14. Стоматология, 269.87kb.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследований
Работа выполнена на базе кафедр акушерства и гинекологии педиатрического факультета, микробиологии и вирусологии ГОУ ВПО ПГМА им. ак. Е.А. Вагнера Росздрава, а также МУЗ МСЧ №9 им. М.А. Тверье г. Пермь. Исследования проведены в 2002–2008 гг.
Ретроспективный анализ демографических показателей проводили на основании данных официальной статистики отдела переписи населения и демографической статистики РОСТАТа Территориального органа Федеральной государственной службы государственной статистики по Пермскому краю (ПЕРМЬСТАТ) за период с 1990 по 2007 г. Изучена многолетняя динамика численности населения, рождаемости и смертности, естественный прирост (убыль), гендерная и возрастная структура населения.
Для анализа уровня, структуры абортов, послеабортных осложнений и показателей применения эффективных методов контрацепции использовали официальную статистическую форму 13 «Сведения о прерывании беременности (в сроке до 28 недель)», а также формы отчетности, принятые Управлением здравоохранения г. Перми (2000 – 2008 гг.).
Гинекологическую заболеваемость оценивали по данным, содержащимся в форме 12 «Сведения о числе заболеваний, зарегистрированных у больных, проживающих в районе обслуживания лечебного учреждения» (2003-2008 гг.).
С целью оценки распространенности НИЗВ изучали сведения, представленные в талонах амбулаторного пациента по данным одной из женских консультаций г. Перми за 2007 г. Учитывали шифры, которые могут относиться к НИЗВ. Шифровка заболеваний проводилась в соответствии с МКБ десятого пересмотра.
Для детального анализа инфекционных заболеваний репродуктивной сферы была разработана собственная форма учета, в которой выделены смешанные формы инфекции различной этиологии (вирусно-бактериальные, бактериально-грибковые и др.).
В условиях Городского консультативно-диагностического центра пренатальной диагностики и планирования семьи МУЗ МСЧ №9 им. М.А. Тверье (ГКДЦ) было обследовано 173 155 женщин, которые обратились к акушерам гинекологам, из них были выделены женщины в возрасте 20-45 лет - 95 977 чел. В этой группе проведено комплексное клинико-лабораторное обследование: клиническое обследование, кольпоскопия, УЗИ органов малого таза, анализ крови на ВИЧ, RW, бактериоскопическое исследование вагинального отделяемого, выявление ДНК M. gentalium, C. traсhomatis, ЦМВ, ВПГ, ВПЧ (16 и 18 тип) в соскобе из цервикального канала, бактериологическое исследование для определения качественного и количественного состава микрофлоры влагалища. Патология репродуктивной сферы впервые выявлена у 40 355 чел., в том числе инфекционные заболевания влагалища и шейки матки различной этиологии у 42,3% (10 410 чел.). В результате выделены две группы: I - пациентки, у которых обнаружено одно инфекционное заболевание (4645 человек), II - больные со смешанными инфекциями (5 765 человек).
После оформления согласия на медицинское вмешательство и в соответствии с критериями включения и исключения были сформированы профильные группы.
Критерии включения:
- возраст обследуемых от 20 до 45 лет;
- жалобы на патологические выделения из половых путей;
- установление диагноза ВВК, БВ, НВВ или смешанных бактериально-грибковых или аэробно-анаэробных бактериальных инфекций влагалища;
- пациентки, обследованные лично автором.
Критерии исключения:
- применение гормональной или внутриматочной контрацепции;
- наличие эктопии шейки матки, острого или обострения хронического экстрагенитального или гинекологического заболевания;
- положительный тест на ВИЧ, сифилис;
- положительные тесты на M. gentalium, C. trachomatis, ВПЧ, ВПГ, ЦМВ, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis.
В результате было выделено 9 профильных групп: I – условно здоровые (42 чел.), II – кандидоносительство (45 чел.), III – бактериальный вагиноз (112 чел.), IV – неспецифический вульвовагинит (107 чел.), V – острый вульвовагинальный кандидоз (61 чел.), VI – хронический вульвовагинальный кандидоз (76 чел.), VII – бактериальный вагиноз + кандидозная инфекция (71 чел.), VIII – неспецифический вульвовагинит + кандидозная инфекция (84 чел.), IX – бактериальный вагиноз + неспецифический вульвовагинит (63 чел.).
После распределения пациенток по группам проведены углубленные иммунологические, экспериментальные исследования.
Клиническое обследование включало традиционный сбор анамнеза. При этом обращали внимание на характер менструальной функции, исход предшествующих беременностей, перенесенные гинекологические, экстрагенитальные заболевания.
При объективном обследовании оценивали общее состояние, выполняли традиционные гинекологические и специальные исследования. Проводили аминотест и рН-метрию влагалищного содержимого с помощью бумажных полосок с ценой деления шкалы 0,5 (фирма «Lachema»).
Клиническая часть исследований также предусматривала отбор проб вагинального секрета для микробиологического, иммунологического анализа. Для стандартизации условий иммунологических исследований забор материала (кровь и вагинальный секрет) проводили преимущественно в позднюю лютеиновую фазу.
Цитологическое и бактериоскопическое исследование вагинального секрета проводили традиционными методами (Р.В. Федоров и др., 1995, Интерпретация результатов цитологического исследования при урогенитальных инфекциях: Метод. рекомендаци. – Пермь, 1998). Состояние микробиоценоза влагалища оценивали по следующим критериям: общая микробная обсемененность, доминирующие морфотипы, наличие дрожжевых клеток, бластоспор, нитей псевдомицелия, эпителиальных и «ключевых» клеток, лейкоцитов. В качестве дополнительных, были предложены следующие тесты: определение суммарного количества лейкоцитов и эпителиальных клеток (СК); определение цитологического коэффициента (ЦК) по соотношению числа лейкоцитов к эпителиальным клеткам (Е.В. Трухина, 2005).
Бактериологическое исследование вагинального секрета. Для выделения и идентификации микробных культур использовали соответствующие питательные среды производства Дагестанского института питательных сред г. Махачкала и НПО «Биомед» г. Пермь, а также хромогенные среды (HiMedia Laboratories Pvt. Limited, Индия).
Исследования проводили согласно методике Р.В. Федорова, Е.Р. Федоровой, Н.Ю. Матюхиной, 1995. Грибы рода Candida выделяли на среде Сабуро, HiCrome Candida Agar; молочнокислые бактерии (лактобациллы и стрептококки) - на среде МРС; энтерококки - при посеве на среду Калины; стафилококки выделяли на желточно-солевом агаре и HiCrome Aureus Agar Base; энтеробактерии определяли при высеве на среду Эндо и HiCrome ЕСС Agar; анаэробы – на обогащенной среде для контроля стерильности, разлитой «высоким столбом» по пробиркам; для выявления клостридиальных форм посев проводили уколом в столбик висмут-сульфит агара.
Выделенные бактериальные культуры идентифицировали на основании изучения морфологических, тинкториальных, биохимических свойств. Применяли также наборы стандартных энтеро-, стафило- и стрептотестов (производство «Лахема», Чехия).
Вагинальный кандидоз подтверждали на основании присутствия грибов рода Candida в количестве более 104 КОЕ/мл. При кандидоносительстве грибы высевали в концентрации, не превышающей 104 КОЕ/мл. При смешанной бактериально-грибковой инфекции влагалища определяли в диагностически значимых титрах грибы рода Candida и другие условно-патогенные микроорганизмы.
Для индикации U. urealyticum использовали жидкую дифференциально-диагностическую среду производства ООО "Научно-производственная фирма "Диагност-мед" г. Омск, которая обеспечивает рост уреаплазм с изменением цвета среды за счет специфической ферментативной активности искомых микроорганизмов. Исследуемый материал засевали в среду, предварительно разлитую по 2 мл в стерильные бактериологические пробирки с ватно-марлевыми пробками. Пробирки помещали в термостат и инкубировали при температуре 370 С в течение 48 часов. Рост уреаплазм сопровождался изменением цвета среды от желтого до зеленого без помутнений.
В ряде случаев для диагностики использовали тест-системы для качественного и полуколичественного определения урогенитальных микоплазм НИИЭМ им. Л.Пастера, г. С.-Петербург, и наборы для идентификации и дифференциального титрования урогенитальных микоплазм "Mykoplasma DUO", Франция, в соответствии с прилагаемыми к ним инструкциями.
Для оценки состояния вагинального биотопа использовали микроэкологические критерии:
индекс доминирования
d = Pi x 100%,
где Pi – доля вида, определяется как ni/N, ni – количество особей данного вида, N – общее количество особей в данной пробе;
индекс Симпсона
С = (ni/N)2
Определение фосфолипазной активности Candida albicans проводили на яично-желточной плотной среде и желточно-буферной смеси. Для исключения продукции клетками C. albicans других видов липаз были проведены специальные тесты. Объектом биохимических исследований являлась культуральная жидкость, полученная при накоплении биомассы Candida. Активность липазы определяли ферментативным колориметрическим методом (метилресоруфиновым методом) с использованием набора реактивов фирмы “Chronolab” (Кат. No. 101-0410).
Морфометрические характеристики клеток и колоний получали с помощью компьютерной микроскопии с использованием установки OLYMPUS (производство Япония) при увеличениях 100х1,36х10 и 4х0,85х10 соответственно. Колонии для этого выращивали на стандартной плотной среде Сабуро и плотной яично-желточной среде Сабуро. Из выросших культур Candida готовили мазки-препараты и окрашивали их по Граму.
Определение активности мураминидазы (лизоцима) в сыворотке крови и влагалищном отделяемом
Активность лизоцима исследовали фотонефелометрическим методом с учетом рекомендаций И.О. Каграмановой (1974). Забор крови и других биологических жидкостей производили одновременно. Поскольку в процессе собственных исследований мы пришли к выводу, что абсолютные величины, характеризующие активность факторов неспецифической резистентности, строго индивидуальны и сами по себе малоинформативны, при сравнительном динамическом анализе мы пользовались условными единицами (УЕ), характеризующими падение оптической плотности в единицу времени (1 час).
Иммунологические исследования были выполнены с учетом фазы менструального цикла – в лютеиновую фазу.
Определение функциональной активности лейкоцитов периферической крови и влагалищного отделяемого проводили с использованием формалинизированных эритроцитов барана.
Рассчитывали процент фагоцитоза (ФП), фагоцитарное число (ФЧ), фагоцитарный индекс (ФИ).
Исследование показателей клеточного звена иммунитета включало определение CD3+, CD4+, СD8+, CD16+, CD20+ лимфоцитов и соотношения CD4+/CD8+, которое выполняли иммуноцитохимическим методом (стрептавидин-биотиновый), использованы реагенты «DakoCytomation», фирмы «Dako», Дания.
Определение уровня иммуноглобулинов периферической крови и влагалищного отделяемого проводили методом радиальной иммунодиффузии в геле по Манчини. Определяли уровень иммуноглобулинов IgG, IgA, IgM в крови и влагалищном отделяемом. Для построения калибровочной кривой использовали наборы стандартных моноспецифических сывороток против иммуноглобулинов человека (IgG, IgA, IgM) производства Н. Новгородского НИИ вакцин и сывороток.
Исследование уровня специфических антител (IgG) к условно-патогенным бактериям и тканевым антигенам выполняли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа. Определяли антитела к бактериальным антигенам (S. aureus, S. epidermidis, Streptococcus sp., E. coli, P. vulgaris, P. mirabilis) и тканевым антигенам (эластин, коллаген, антигены почек, печени, гипофиза, надпочечников, щитовидной железы).
Для исследования были использованы тест системы (г. Москва), содержащие сорбированный индивидуальный препарат бактериальных антигенов, выделенных из клеток, и тканевые антигены.
Определение уровня цитокинов периферической крови и влагалищной жидкости проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа в соответствии с инструкцией. Для исследования использовали наборы реагентов ProCon ILβ-1, IL-2, IL-6, IL-4, TNF-α, IFN-γ фирмы «Протеиновый контур», С.-Петербург.
Кристаллографическое исследование влагалищной жидкости Фации влагалищной жидкости (ВЖ) получали методом клиновидной дегидратации (Шабалин В.Н., Шатохина С.Н., 1998 г.). Для фотоизображений использовали бинокулярную лупу МБС-9 и цифровую фотокамеру OLYMPUS. Анализ проводили с применением программы IMAGE-PRO+ (1995г.), оценивали разделение фации влагалищной жидкости на центральную, промежуточную и периферическую зоны, их ширину, однородность, расположение и форму кристаллов.
Экспериментальное моделирование инфекционного процесса на животных
В качестве модели были выбраны лабораторные кролики беспородные самки в возрасте 7-9 месяцев, живой массой 2-3 кг, которые не допускались к спариванию (18 особей). Первичное обследование включало осмотр, бактериоскопическое и бактериологическое исследование вагинального отделяемого. Затем животных разделили на три группы (по 6 особей): I – введены во влагалище St. аureus, II – E. сoli, III – C. albicans (инокулюм содержал порядка 1,5х108 КОЕ/мл, что соответствует 5 ЕД стандарта мутности). Повторно осмотр и забор материала проводили через 5 и 10 дней после заражения.
На десятый день было забито по 2 кролика из I и II групп. Для гистологического исследования взят материал стенки влагалища и периферические лимфатические узлы. Затем животным I (3 кролика) и II (2 кролика) групп на 10 день эксперимента были дополнительно введены во влагалище C. albicans. Контрольное обследование выполняли через 5 и 10 дней после повторного заражения.
Для морфологических исследований материал разрезали на кусочки и фиксировали в жидкости Карнуа, далее проводили “заливку” в парафиновые блоки по общепринятой методике. С помощью санного микротома готовили срезы толщиной 4-5 мкм. Для выявления общей гистологической картины органа срезы окрашивали гематоксилином и эозином.
Цифровой материал, полученный в результате исследований, обрабатывали методом вариационной статистики на компьютере Pentium с использованием программы «Microsoft Excel» (пакет анализа данных). Проводили линейную корреляцию, вычисляя коэффициент корреляции Pearson (r) Разницу считали достоверной при уровне значимости p<0,05, то есть когда вероятность различия была более 95%.
Для оценки статистической значимости различий между выборками использовали однофакторный дисперсионный анализ, критерий Ньюмена-Кейлса, критерий
. Разницу считали достоверной при уровне значимости p<0,05, то есть когда вероятность различия была более 95%.С целью установки связи между двумя величинами использовали уравнение регрессии. Результаты статистической обработки данных визуализировали с помощью таблиц, графиков и диаграмм.
Статистический анализ показателей полученных при компьютерной микроскопии, проведен с использованием программ Image-Pro (версия Demo).