Хронический гастрит типа в как фактор, способствующий развитию вирусного гепатита а

Вид материала

Диплом

Содержание Умарова А.А., Остроумова И.А., Арипова Т.У, Ризопулу А.П., Пулатов Д.А. Материал и методы. Результаты и обсуждение Борисов Л.Б. Медицинскаямикробиология, вирусология, иммунология. – Москва. – 2002. – с. 189. Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток и липопротеинов.- М.: Наука.-1989.-208 с. Игнатова Т.М., Серов В.В.. Патогенез хронического гепатита С // Архив патологии.-2001.-3.-с.54-59. Сторожаков Г.И., никитин И.Г.. Хронические вирусные заболевания печени – системные инфекции // Терапевтический архив.-1998.-2.-с Ходжаев Ш.Х.. Состояние диагностики и дифференциальной диагностики вирусных гепатитов в Узбекистане // Журнал Истеъдод.-1999.-3. Virus, and Human Immunodefficiency Virus Infection on Uzbekistan // Intervirology 2001; 44: 327-332.

Подобный материал:

• Бесприборные ифа тест-системы для дифференциации гепатитов а, В, с дробченко С. Н.,, 46.32kb.
• Иммунологические особенности острого вирусного гепатита в в зависимости от исходов, 255.83kb.
• Граф логической структуры темы “Хронический гастрит у детей”, 54.15kb.
• «заболевания органов пищеварения», 625.96kb.
• Незаконная миграция, как фактор способствующий наркобизнесу и нелегальным оборотом, 33.26kb.
• Ьным распространением, часто тяжелым и длительным течением, неблагоприятными последствиями, 73.48kb.
• Рекомендации по применению препарата профеталь® в терапии хронического вирусного гепатита, 24.33kb.
• «Всё о вирусном гепатите», 196.8kb.
• Лечение грязью на яровом, 569.63kb.
• Методические рекомендации для студентов III курса стоматологического факультета для, 522.54kb.

ИММУНОФЕНОТИП И БИОФИЗИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ ПОВЕРХНОСТНЫХ МЕМБРАН ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У БОЛЬНЫХ ГЕПАТОЦЕЛЛЮЛЯРНЫМ РАКОМ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ НАЛИЧИЯ HBV- И HCV-ИНФЕКЦИЙ В ЭТИОЛОГИИ ЗАБОЛЕВАНИЯ.

Умарова А.А., Остроумова И.А., Арипова Т.У, Ризопулу А.П., Пулатов Д.А.

Институт иммунологии АН РУз, Республиканский Онкологический Научный Центр МЗ РУз (Узбекистан)

Заболевания печени, обусловленные вирусами гепатита В (HBV) и С (HCV), включают в себя острый и хронический гепатит, цирроз и гепатоцеллюлярный рак печени. Эти вирусы выступают в роли самостоятельных этиологических факторов хронических заболеваний печени.

Согласно данным ВОЗ в мире насчитывается более 850 млн носителей HBV- и HCV-инфекций, из которых свыше 1 млн 250 тыс человек ежегодно погибают от гепатоцеллюлярного рака (ГЦР) 1,10. Несмотря на мощный гуморальный и клеточный иммунный ответ при острой HBV- и HCV-инфекции у 25% и 85% соответственно развиваются хронические формы вирусных гепатитов В и С. Ключевую роль в содействии персистенции вирусов гепатита играют активная вирусная репликация и развитие иммунопатологических механизмов макроорганизма. При формировании хронического воспаления вирусы для обеспечения собственного выживания используют пути, которые позволяют им избежать действия защитных иммунных реакций организма 5,6.

Известно, что вирусы различной природы, в первую очередь затрагивают мембраны клеток, вызывая нарушения их биофизических параметров 2,3. Кроме того, для клеток иммунной системы, формирующих иммунный ответ и несущих на своей поверхности множество экспрессированных рецепторов, биофизическое состояние поверхности мембраны имеет первостепенное значение.

Узбекистан относится к странам с высокой активностью эпидемического процесса гепатитов В и С 8,11,12. Однако несмотря на постоянно расширяющийся объем знаний о причинах болезней печени, многие вопросы, касающиеся механизмов возникновения и прогрессирования ГЦР на фоне хронических заболеваний печени вирусной этиологии, остаются открытыми. Механизмы перехода адекватной иммунной реакции в иммунопатологическую при длительной персистенции вирусов гепатита В и С, остаются недостаточно изученными.

Учитывая разную природу вирусов: ВГВ – ДНК-содержащий вирус, а ВГС – РНК-содержащий вирус, нам представило большой интерес проанализировать роль вирусных гепатитов В и С, а также иммунологические параметры и некоторые биофизические свойства поверхностных мембран лимфоцитов ПК больных ГЦР в зависимости от этиологического фактора.

Материал и методы. Нами было обследовано 64 больных ГЦР (42 мужчин и 22 женщины), которые находились в РОНЦ МЗ РУз и Ташкентском Онкологическом диспансере с 2000 по 2002 гг. Средний возраст всех больных ГЦР составил 541,3 года. Контрольную группу составили 29 практически здоровых лиц аналогичного возраста и пола.

Маркеры вирусных гепатитов В (HBsAg) и С (анти-HCV антител) определяли в сыворотке крови методом пассивной агглютинации желатиновых частиц с использованием тест-систем “Serodia” (Япония).

Кровь на иммунологические и биофизические 7 исследования забирали из локтевой вены, в объеме 5 мл на гепарин (24 ЕД/мл) с последующим выделением мононуклеаров на градиенте плотности (р=1,077 г/л) (Boym, 1969).

Определение дифференцировочных и активационных маркеров на CD3, CD4, CD8, CD16, CD72, CD25, CD95 на лимфоцитах проводили с помощью моноклональных антител производства (НПЦ Мед БИО Спектр, МЗ РФ) методом непрямого розеткообразования в соответствии с методическими рекомендациями 4. Фагоцитарную активность нейтрофилов (ФАН) периферической крови определяли по их способности поглощать частицы меламинформальдегидного латекса размером 1,5-2 мкн. Уровень сывороточных иммуноглобулинов выявляли методом радиальной иммунодифузии в геле по Манчини (1969).

С целью определения биофизических параметров мембран лимфоцитов ПК применяли метод флюоресцентного зондирования 3. Нами был использован зонд 1,8 АНС (1№-фенилонафтилсульфонат) фирмы “Serva” (Германия). Спектры флуоресценции зонда АНС, аккумулированного лимфоцитами, снимали на спектрофлуориметре “Contron” (Германия). С этой целью в кювету наливали 500 мкл зонда АНС. Длина волны возбуждения зонда АНС 370 нм, спектр флуоресценции в системе лимфоциты/АНС снимали в диапозоне 400-550 нм. Об изменениях заряда поверхностной мембраны лимоцитов судили по величине максимальной флуоресценции лимфоцитов в группе больных по сравнению с контролем.

Полученные результаты обработаны стандартными методами вариационной статистики.

Результаты и обсуждение. Результаты серологического исследования показали, что у 46,9% больных ГЦР был выявлен HВsAg и у 29,6% - анти-HCV антитела (табл.1).

Таблица 1

Маркерный профиль больных ГЦР в зависимости от этиологического фактора заболевания

Больные ГЦР	Количество больных	HВsAg-позитивные	анти-HCV антитела	Итого
Абс.	64	30	19	49
%	100	46,9	29,6	76,5

Таким образом, у 76,5% больных ГЦР были выявлены маркеры вирусных гепатитов В и С, что подтвердило ведущую роль вирусов гепатита В и С в развитии ГЦР.

У 23,4% больных мы не смогли выявить конкретных этиологических факторов. Возможно, развитие рака печени было связано с алкогольным поражением, воздействием токсических препаратов, а также наличием паразитарных заболеваний в прошлом 6,10.

Результаты иммунологических исследований показали, что при ГЦР с наличием HBV- и HCV-инфекции были выявлены выраженные изменения клеточного звена иммунитета, характеризующиеся выраженной лимфопенией, низкой экспрессией CD3+ - общего популяционного маркера Т-лимфоцитов, CD4+Т-хелперов/индукторов, что свидетельствовало о достаточно слабом CD4+Т-клеточном пролиферативном иммунном ответе на антигены вирусов и опухоли. У всех больных ГЦР наблюдалось значительное повышение экспрессии CD8+Т-цитотоксических лимфоцитов, обладающих супрессорным эффектом. Причем достоверно высокое значение экспрессии CD8+ было выявлено у больных ГЦР с наличием HCV-инфекции.

Следовательно, глубокий Т-клеточный иммунодефицит у всех больных ГЦР, в частности у больных с наличием вирусных гепатитов В и С, был сопряжен с дисбалансом иммунорегуляторных субпопуляций Т-лимфоцитов, выражающийся глубоким дефицитом числа Т-хелперов/индукторов и значительным повышением Т-супрессоров/цитотоксических лимфоцитов. Полученные результаты представлены на рис.1.

Пониженная реактивность Т-звена иммунитета при ГЦР, возникшим на фоне хронического гепатита В и С, может рассматриваться либо как результат нарушения представления антигена АПК, либо как нарушение функции самих Т-клеток в результате изменения биофизических свойств их поверхностных мембран (табл.2). Известно, что функции мембран лимфоцитов тесно связаны с физическим состоянием липидного бислоя и белково-липидных комплексов. Изменение липидного состава мембран ведет к изменению экспрессии рецепторов, к активности или ингибиции функций иммунокомпетентных клеток.

Микровязкость и заряд поверхностной мембраны лимфоцитов ПК оценивали по величине максимальной флуоресценции. К одному из преимуществ метода можно отнести то, что использованный зонд не нарушает транспортные потоки клеток, а лишь в них вовлекается и по скорости его передвижения через клеточные мембраны и по изменению его спектральных характеристик можно судить о модификациях биофизического состояния клеточных мембран.

Сравнительный анализ показал, что наличие вирусов гепатитов В или С оказывает выраженное влияние на микровязкость мембран. Нами были выявлены достоверные различия в состоянии микровязкости мембран лимфоцитов у больных с наличием ВГВ и ВГС (р<0,05). Микровязкость мембран лимфоцитов у больных невирусной этиологии находилась в промежуточном положении между данными здоровых и больных ГЦР с наличием гепатитов В и С.

Таким образом, отклонение длины волны максимальной флуоресценции в коротковолновой диапозон указывало на повышение микровязкости поверхностных мембран лимфоцитов ПК, что свидетельствовало о приобретении мембранами лимфоцитов более жесткостных и менее пластичных свойств. Жесткостность мембраны лимфоцитов ПК указывало на угасание метаболических процессов в мембране клетки, тем самым затрудняя активацию лимфоцитов, процессы распознавания лимфоцитами своих или чужих клеточных рецепторов, что в конечном итоге приводило к формированию неадекватного иммунного ответа.

Исследование заряда поверхностных мембран лимфоцитов выявило, что суммарный отрицательный заряд на мембране лимфоцитов был значительнее увеличен у больных ГЦР с наличием ВГВ и ВГС. Причем, значительное усиление электрического поля было характерно для больных ГЦР с наличием HCV-инфекции.

Таблица 2

Показатели биофизических свойств поверхностных мембран лимфоцитов ПК больных ГЦР в зависимости от этиологического фактора заболевания

Группы	Высота максимальной флуоресценции (Н)	изменение заряда	Длина волны макс. флуоресценции	изменение микровязк.
здоровые доноры	85,28,11	норма	474,51,0	норма
все больные ГЦР	42,45,30	 на 50%	468,21,47*	повышена
ГЦР с HBV-инфекцией	37,15,72	 на 56%	466,41,48*	повышена
ГЦР с HCV-инфекцией	34,75,01	 на 60%	463,21,27*	повышена
ГЦР невирусной этиологии	49,95,09	 на 41%	470,61,77	повышена

Примечание: * - достоверные различия с группой контроля.


Следовательно, усиление электрического поля лимфоцита, что и было нами установлено, вызывает автоматическое увеличение числа противоионов, которые формируют дополнительную, ионную “шубу” вокруг лимфоцитов. Чем плотнее становится “шуба” вокруг лимфоцитов, тем сложнее осуществлять межклеточные контакты, распознавать друг друга и чужеродные антигены, и формировать адекватный иммунный ответ.

Таким образом, нами выявлены статистически значимые изменения в биофизических параметрах поверхностных мембран лимфоцитов, выполняющих функцию надзора, которая является основой для иммунной системы организма, у больных ГЦР она ослабляется или совсем исчезает.

Установлено, что HBV и HCV, являясь внутриклеточными патогенами, обладают тропизмом и способностью реплицироваться в клетках иммунной системы и клетках костного мозга, включая моноциты/макрофаги, В- и Т-лимфоциты, что дает возможность этим вирусам избегать иммунологический надзор. Другим механизмом уклонения от иммунного распознания, является высокая мутационная изменчивость и снижение иммунногенных свойств самих вирусов при хронизации процесса. Мутации в геноме HBV и HCV способствуют маскировке и ускользанию их от цитотоксического действия киллерных клеток .

Нами выявлено значительное повышение экспрессии CD72+ - общего популяционного рецептора В-лимфоцитов. Причем значительное повышенное содержания CD72+ маркеров наблюдалось у больных ГЦР, ассоциированным HBV- и HCV-инфекциями по сравнению с больными ГЦР невирусной этиологии. У всех больных ГЦР было выявлено наличие дисбаланса в содержании основных классов иммуноглобулинов. У больных ГЦР отмечался подъем IgA и IgG, на фоне дефицита IgM.

Однако, несмотря на поликлональную активацию гуморального звена иммунитета, причинами ускользания от вируснейтрализирующих антител служат высокая мутационная изменчивость вирусного генома, одновременное существование квази-штаммов, что наиболее характерно для HCV-инфекции, а также повышенное содержание альфа-фетопротеина (АФП – специфического маркера гепатоцеллюлярного рака) в опухолевых клетках, который также может индуцировать образование антител, выступая в роли специфического опухолевого антигена. Эти антитела препятствуют отторжению опухоли, блокируя те детерминанты антигенов против которых направлены специфические рецепторы иммунокомпетентных клеток т.е. развивается эффект ускорения роста опухоли антителами.

Нарастание уровня Ig G при генерализации процесса и при длительной персистенции вирусных гепатитов В и С обусловлено, по всей вероятности тем, что они ответственны за иммунологическую память. Очевидно, антитела к HBsAg и анти-НCV, и фракции иммуноглобулина G являются отражением контакта организма с ними. В зависимости от условий они могут выполнять как защитную функцию, инактивируя антиген и ограничивая дальнейшее инфицирование интактных гепатоцитов, так и повреждающую, формируя с НВs-антигеном иммунный комплекс, который в присутствии комплемента способствует дальнейшей деструкции ткани печени.

Среди факторов естественного иммунитета особое место занимают ФАН и ЕКК (естественные киллерные клетки). У больных с ГЦР, ассоциированным вирусными гепатитами В и С, наблюдалось достоверное снижение фагоцитарной активности нейтрофилов и повышенная экспрессия CD16+ маркера ЕКК по сравнению с больными ГЦР невирусной этиологии. Возможно это связано с повышением в периферической крови их незрелых форм, что указывает на недостаточность естественных защитных факторов. Кроме того, установлено, что при вирусном канцерогенезе в первую очередь страдают механизмы генерации в зрелые формы и активации NK-клеток.

Анализ экспрессии активационных маркеров CD25+ и CD95+, несущих рецепторы к ИЛ-2 и к FAS/APO-1, опосредующего физиологический апоптоз, выявил достоверное повышение экспрессии CD25+ у больных ГЦР с наличием HBV-инфекции и CD95+ у больных ГЦР с наличием HCV по сравнению с больными ГЦР невирусной этиологии. Очевидно, что качественные и количественные нарушения в экспрессии CD25+ и CD95+ имеют решающее значение в развитии патологического процесса. Повышение уровня CD95+ на лимфоцитах у больных ГЦР с HBV-и HCV-наличием можно объяснить тем, что для вирусных гепатитов В и С характерной является репликация их в “иммунонеприкосновенных зонах”, каковыми являются клетки иммунной системы. Таким образом, доказанная лимфотропность этих вирусов и способность их к мутациям обеспечивает возможность им “ускользать” от иммунного надзора. Повышенная экспрессия CD95+рецепторов на лимфоцитах, указывает на использование HBV и HCV механизма апоптоза лимфоцитов для своего выживания в организме. Кроме того, вирусная инфекция, не обладая прямым онкогенным действием, в условиях многолетней персистенции как в гепатоцитах, так и в иммунокомпетентных клетках, активирует клеточные онкогены. Это с одной стороны, приводит к усиленной пролиферации, а с другой стимулирует апоптоз, т.е. “программирует” ускоренную гибель клеток.

Таким образом, нами выявлены характерные иммунологические сдвиги у больных ГЦР в зависимости от этиологических факторов, затрагивающие более глубокин стороны клеток иммунной системы – мембранные.

ЛИТЕРАТУРА

1. Борисов Л.Б. Медицинскаямикробиология, вирусология, иммунология. – Москва. – 2002. – с. 189.

2. Владимиров В.А. Роль нарушений липидного слоя мембран в развитии патологических процессов // Патофизиология и эксперим. Терапия.-1990.-№4.-с.970-973.

3. Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток и липопротеинов.- М.: Наука.-1989.-208 с.

4. Залялиева М.В., Прохорова Р.С. Способы определения субпопуляций лимфоцитов // №1 DP 20000774 D/P МПК 6601 №33/48 26.02.2001.

5. Ивашкин В.Т., Мамаев С.Н., Буеверов А.О., Шульпекова Ю.О.. взаимодействие гепатита В и С с клетками системы макроорганизма (обзор литературы) // Клиническая лабораторная диагностика.- 2001.-7.-с.45-48.

6. Игнатова Т.М., Серов В.В.. Патогенез хронического гепатита С // Архив патологии.-2001.-3.-с.54-59.

7. Методика выделения тимоцитов. Методы изучения in vitro клеточного иммунитета. Под. ред. В.Влума, Глейда.-М.-1974.

8. Кузин С.Н., Лисицина Е.В., Самохвалов Е.И. и др. Распространение гепатита С и отдельных генотипов вируса гепатита С в регионе с умеренной активностью эпидемического процесса // Вопр. Вирусологии.- 1999.- 2.- с.79-82.

9. Сторожаков Г.И., никитин И.Г.. Хронические вирусные заболевания печени – системные инфекции // Терапевтический архив.-1998.-2.-с.80-82.

10. Пасечников В.Д., Чуков С.З. Некоторые вопросы эпидемиологии, диагностики и лечения гепатоцеллюлярной карциномы // Рос. журн. гастроэн., гепатол., колопроктол. – 2002.–2.- с.30-36.

11. Ходжаев Ш.Х.. Состояние диагностики и дифференциальной диагностики вирусных гепатитов в Узбекистане // Журнал Истеъдод.-1999.-3.-с.56-58.

12. Ruzibakiev R., Kato H., Ueda R., Yuldasheva N., et al. Risc Factors and Seroprevalence of Hepatitis C

13. Virus, and Human Immunodefficiency Virus Infection on Uzbekistan // Intervirology 2001; 44: 327-332.