Отчет о научно-исследовательской работе

Вид материала

Отчет

Содержание Особенности функционирования липолитических ферментов 1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем Носители для иммобилизации ферментов Методы иммобилизации ферментов Физические методы. Химические методы. Свойства иммобилизованных ферментов

Подобный материал:

• Реферат отчет о научно-исследовательской работе состоит, 61.67kb.
• Отчёт о научно-исследовательской работе за 2011 год, 1208.93kb.
• Отчёт о научно-исследовательской работе за 2009 год, 851.3kb.
• Отчёт онаучно-исследовательской работе гу нии но ур за 2010 год, 997.69kb.
• Отчет о научно-исследовательской работе профессорско-преподавательского состава, 617.56kb.
• Отчет о научно-исследовательской работе; пояснительная записка к опытно-конструкторской, 14.47kb.
• Отчет о научно-исследовательской работе (итоговый), 2484.06kb.
• Отчет о научно-исследовательской работе, 2473.27kb.
• Отчет о научно-исследовательской работе, 392.92kb.
• Задачи секции: широкое привлечение учеников к участию в научно исследовательской работе;, 67.94kb.

Особенности функционирования липолитических ферментов

Согласно основному постулату энзимологии, фермент и субстрат образуют комплекс, в котором протекает реакция и который затем распадается на исходный фермент и продукты реакции. Кинетические уравнения, выведенные на основании этого постулата, в целом, применимы также к реакциям липолитических ферментов с их субстратами. Так, было показано, что гидролиз триглицеридов липазой поджелудочной железы подчиняется основному уравнению Михаэлиса-Ментен [15, 16, 24]. Однако, это уравнение в случае липолитических реакций носит довольно формальный характер, поскольку ферментативный гидролиз липидов – это гетерогенная реакция, происходящая на границе раздела фаз, поскольку фермент растворим в воде, а субстрат - нет. Следовательно, фермент-субстратное взаимодействие должно также протекать на поверхности раздела между агрегированным субстратом и водой [15, 24]. К липолитическим ферментам относятся и внутриклеточные фосфолипазы, которые связаны с мембранами и не отличаются в этом отношении от других мембранных ферментных комплексов [27]. Однако типичные липолитические ферменты - липазы и фосфолипазы пищеварительных желез, ядов, жировой ткани и крови - функционируют в специфических условиях: субстрат практически «неподвижен» по отношению к ферменту. Такое поведение субстрата обусловлено его агрегацией в мицеллы. Во время липолиза, очевидно, фермент должен находить субстрат, а не наоборот; в этом случае под «субстратом» подразумевается не отдельная его молекула, а неводная фаза агрегированного липида (мицеллы) [24]. Тем не менее, липолиз в среде и биомембраннах имеют то общее, что их кинетика ограничивается двумя измерениями вместо трех и один из участников реакции (фермент или субстрат) частично иммобилизован на границе раздела фаз (в «отдельной матрице»). Термин «суперсубстрат» был предложен для обозначения матрицы, в которую встроена молекула субстрата [24]. В липолитических реакциях такой матрицей может служить поверхность триглицеридной капли или фосфолипидной мицеллы, и тогда она представляет собой агрегат многих молекул субстрата. Матрица может быть поверхностью, модифицированной включением несубстратных участников реакций, таких, как амфифильные катионы или анионы. Необходимо, чтобы ферменты не только перемещались к «суперсубстрату» и связывались с ним, но чтобы при этом соблюдалась бы и правильная ориентация активных центров вблизи молекул субстрата, находящихся в «суперсубстратной» фазе. Таким образом, кинетика липолиза соответствует общим критериям кинетики ферментативной реакции, но имеет также существенные отличия.

Скорость всех химических реакций зависит от температуры, поэтому катализируемые ферментами реакции также чувствительны к изменениям температуры. Установлено, что скорость большинства биохимических реакций повышается в 2 раза при повышении температуры на 10 °С и, наоборот, снижается в 2 раза при понижении температуры на 10 °С [29]. Этот показатель получил название температурного коэффициента. Однако вследствие белковой природы фермента тепловая денатурация при повышении температуры будет снижать эффективную концентрацию фермента с соответствующим снижением скорости реакции. Так, при температуре, не превышающей 45-50 °С, скорость ферментативной реакции увеличивается согласно теории химической кинетики. При температуре выше 50 °С на скорость реакции большое влияние начинает оказывать тепловая денатурация белка-фермента, приводящая к постепенному прекращению ферментативного процесса [16, 24].

Оптимальной для действия большинства ферментов теплокровных животных является температура порядка 36 - 40 °С; в этих условиях скорость реакции оказывается максимальной вследствие увеличения кинетической энергии реагирующих молекул. При высоких температурах белковая глобула претерпевает денатурацию и теряет свою активность. При низких температурах (0 °С и ниже) ферменты, как правило, не разрушаются, хотя активность их падает почти до нуля. Во всех случаях имеет значение время воздействия соответствующей температуры. Следует отметить, что на термолабильность ферментов определенное влияние оказывает концентрация субстрата, рН среды и некоторые другие факторы [16, 24].

Ферменты активны только в определенном интервале рН. Многие аминокислоты, звенья белковых молекул, обладают функциональными группами, способными к ионизации. Возможность участия данной группы в катализе зависит от ее ионного состояния. Оптимальный для катализа баланс протонированных и непротонированных групп определяет величину рН-оптимума данного фермента, который обычно лежит в физиологическом интервале значений рН среды. Вид зависимости активности фермента от величины рН реакционной среды будет иметь вид колоколообразной зависимости, а значение рН, при котором достигается максимальная активность фермента, называется рН-оптимумом ферментативной реакции.

Если ионизационные процессы не меняют константу связывания субстрата с ферментом, то величина константы Михаэлиса от рН зависеть не будет. Если же ионизация групп в активном центре фермента переводит его в форму, не способную связывать субстрат, то независимой от величины рН становится константа каталитическая. На практике, конечно, картина обычно бывает гораздо более сложной, поскольку в состав активного центра могут входить много ионизующихся групп. Большое значение имеет состояние ионизации субстратов и кофакторов, величина ионной силы среды. На скорость гидролиза липазой любого выбранного субстрата может оказывать влияние целый ряд различных соединений. В системе, используемой для определения липазы, часто содержатся хлористый натрий и кальций, соли желчных кислот, другие белки и различные виды эмульгаторов [29].

Таким образом, для каждого типа ферментов (из рассмотренных выше и многих других) использование идеологии супрамолекулярных ферментативных систем позволяет как глубже понять их сложную структурную организацию, так и наиболее адекватно отразить реальные ситуации их функционирования в организмах животных и человека.


1.1.4 Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментативных систем

Иммобилизованные ферменты представляют собой важную и быстро развивающуюся область энзимологии и биотехнологии [24, 28, 29].

В 1971 г. на первой конференции по инженерной энзимологии в Хенникере (США) было введено в биохимическую терминологию понятие «иммобилизованные ферменты». Процесс иммобилизации ферментов можно рассматривать как методический прием, при котором молекулу белка включают в любую фазу, отделенную от фазы самого раствора, но способную обмениваться с ней молекулами субстрата или модификатора (ингибитора, активатора и т.д.). Иммобилизованные ферменты имеют существенные преимущества по сравнению с нативными ферментными препаратами. Так, например, они легко отделимы от реакционной среды. Это дает возможность остановить реакцию в любой момент, получить продукт, незагрязненный катализатором, и использовать ферментный препарат многократно. Иммобилизованные ферменты технологичны, что определяется возможностью вести биотехнологический процесс непрерывно и регулировать скорость катализируемой реакции и выход продукта путем изменения скорости протока. Подбором соответствующих носителей и методов иммобилизации можно целенаправленно модифицировать такие свойства ферментов, как специфичность, рН- и термозависимость, а также стабильность фермента при денатурирующих воздействиях. Успешное использование иммобилизованных ферментов определяется выбором подходящего сочетания носителя и метода иммобилизации, а также знанием кинетики реакций с участием таких катализаторов [29].

Иммобилизованные ферменты можно использовать, главным образом, в следующих направлениях: для анализа различных веществ; для бумажной, текстильной, химической и фармацевтической промышленности; для обработки сточных вод; как лекарственные средства [30-37]. Последнее является наиболее ценным для медицины и ветеринарии. Лечебные средства на основе иммобилизованных ферментов применяются либо в том случае, когда необходимый фермент отсутствует в тканях, вследствие генетических или других нарушений, либо в качестве агентов, разрушающих нежелательные компоненты, например, мочевину. Использование чужеродных (бактериальных) ферментов зачастую нежелательно, вследствие того, что они могут стать причиной аллергических реакций и, кроме того, они крайне неустойчивы. Иммобилизация позволяет обойти эти барьеры, так как она повышает стабильность фермента и препятствует его взаимодействию с иммунной системой организма (например, для освобождения крови от мочевины в аппарате "искусственная почка" использоваться колонка с иммобилизованной уреазой). Такие ферменты применяют в лечебных целях и тогда, когда они необходимы, но по причине различных патологических процессов их недостаточно в организме.


Носители для иммобилизации ферментов

В качестве носителей для иммобилизованных ферментов могут использоваться различные вещества - природные и синтетические, органические и неорганические, высоко- и низкомолекулярные, но все они должны отвечать следующим требованиям: высокая химическая и биологическая стойкость; высокая механическая прочность, например, к истиранию; возможность получения различных форм - гранул, пластин, мембран, трубочек и т.д.; высокая гидрофильность, обеспечивающая возможность связывания фермента с носителем в водной фазе; легкость активации фермента, связанного с носителем; способность носителя к максимальной "нагрузке" ферментом, так как высокая концентрация фермента на носителе позволяет уменьшить размеры реактора; низкая стоимость. Органические высокомолекулярные носители делят, как правило, по происхождению на природные и синтетические полимеры.

Природные полимеры, используемые для иммобилизации подразделяются на белковые, полисахаридные и липидные. Наиболее широко в качестве носителей используются полисахариды, такие как целлюлоза, декстран, агароза и их производные. Их преимуществом являются доступность, наличие различных функциональных групп, высокая степень гидрофильности, недостатком - чувствительность к действию микроорганизмов и высокая стоимость. Синтетические полимерные носители для иммобилизации ферментов создаются на основе многих полимеров (производные стирола, акриловая кислота, поливиниловый спирт, полиуретан и т.д.).

Известно, что in vivo большинство ферментативных реакций протекает на поверхности внутриклеточных или клеточных мембран, поэтому модель фермент-липид наиболее приближена к условиям функционирования энзима в клетке. Липидные носители используются в виде монослоев на различных поверхностях или в виде бислоев сферической формы (липосомы или везикулы). Простота получения, легкость регенерации иммобилизованного катализатора, возможность использования его in vivo способствовали широкому применению липосом или везикул в качестве носителей ферментов и лекарственных препаратов.

В настоящее время в качестве носителей внедряются синтетические аналоги липидов - поверхностно-активные вещества (ПАВ). Они имеют амфифильную природу и содержат неполярную углеводородную часть и полярную «головку», от содержания в которой различных функциональных групп различают 4 типа ПАВ: анионные, катионные, неионные и цвиттерионные. Многие из известных ПАВ являются продуктами крупнотоннажного производства. Синтетическими аналогами липидов в качестве носителей для иммобилизации являются моющие средства (СМС), в состав которых входят смеси ПАВ с протеолитические ферментом.

Неорганические носители - это матрицы на основе силикагеля, глины, керамики, природных минералов и их оксидов. Они могут быть пористыми и непористыми и применяются в виде шариков и монолита. Преимущества этих носителей в легкости регенерации и придании им любой конфигурации.


Методы иммобилизации ферментов

Методы иммобилизации ферментов подразделяют на физические и химические (при использовании последних между ферментом и носителем образуются ковалентные связи).

Физические методы. Самым известным и доступным способом иммобилизации является физическая адсорбция. В основе этого способа лежит физическое или ионное взаимодействие фермента с носителем, который может быть как неорганическим, так и органическим веществом. Проведение адсорбции очень простой процесс и заключается в контакте водного раствора фермента с носителем и отмывке не адсорбированного фермента. Более удобным способом является колоночный, когда раствор фермента «прокачивают» через колонку с носителем и последующее отмывание проводят в этой же колонке. Преимущества адсорбционной иммобилизации - простота методики, доступность и дешевизна сорбентов, возможность придания им любой формы. Недостаток - десорбция и ее последствия. Это связано с тем, что сорбция обратима, она зависит от рН и ионной силы раствора, температуры, удельной поверхности и пористости носителя, концентрации субстрата и т.д. Недостатков адсорбции удается избежать при иммобилизации ферментов в поры геля. Это тоже физический метод, заключающийся в том, что энзим как бы погружают в матрицу геля, отделяющего его от субстрата полупроницаемой оболочкой. Методически такая процедура выполняется различными способами: а) готовый полимерный гель пропитывают раствором фермента, но поскольку этот способ требует много времени, а полученный препарат обладает низкой удельной активностью, он применяется редко; б) фермент вносят в раствор мономеров до проведения их полимеризации; в) фермент вносят в раствор готового полимера до его перехода в гель. Гели, используемые для иммобилизации ферментов, содержат 50-90% воды, заполняющей пространство между полимерными цепями. Фермент, заключенный в матрицу геля, не может выйти наружу, во-первых, потому что расстояние между соседними цепями полимера меньше размеров его молекулы и, во-вторых, из-за наличия ионных и водородных связей фермента с носителем.

Для иммобилизации ферментов применяются как несшитые полимерные гели, образующиеся полисахаридами (крахмалом, агар-агаром, альгинатом, каррагинаном и др.) при охлаждении их горячих растворов; так и сшитые полимерные гели, образуемые поливиниловым спиртом (ПВС) или поливинилпирролидоном, в которых при воздействии ультрафиолетового света, гамма-излучения или потока электронов возникают свободные радикалы, что приводит к образованию ковалентных сшивок между цепями.

В настоящее время широкое распространение получили сшитые гели на основе производных акриловой кислоты - полиакриламидные гели (ПААГ). Включение фермента проводится на стадии синтеза полимера из мономера - акриламида в присутствии сшивающего агента – метилен-бисакриламида. Образующийся блок геля с включенными в его матрицу молекулами фермента может быть подвергнут механическому воздействию для получения частичек разной величины и формы (шарики, волокна, пленки и т.д.). Преимущества для ферментов, включенных в матрицу геля, заключаются в том, что активный центр фермента не блокирован и фермент надежно защищен от действия бактерий. Недостатки: фермент может вымываться из геля и полимерная матрица может в какой-то мере препятствовать проникновению субстрата в гель, снижая таким образом активность фермента [30-37].

Другие взаимодействия возникают между носителем, ферментом и субстратом при иммобилизации ферментов с использованием полупроницаемых оболочек. Например, микрокапсулирование – достаточно простой метод, основанный на создании вокруг капелек ферментного раствора полупроницаемых микрокапсул определенных размеров и пористости. Метод двойного эмульгирования заключается в том, что эмульсию, полученную при микрокапсулировании, диспергируют повторно в воде. Из капель органического раствора полимера образуется водная эмульсия, содержащая еще более мелкие капли водного раствора фермента. При затвердевании органического раствора образуются полимерные сферические частицы, внутри которых заключены молекулы ферментов.

Одним из новых и перспективных является метод включения ферментов в везикулы. Везикулы - это концентрические сферы из двойных фосфолипидных слоев. Везикулы с включенными в них препаратами используют в медицине для введения некоторых лекарств и в фундаментальных исследованиях в качестве системы, имитирующей клетки. Все методы с использованием полупроницаемых оболочек просты, универсальны и позволяют получать различные формы иммобилизованного биокатализатора - капсулы, волокна, шарики и т.п. При этом ферменты достаточно стабильны, их активность не ограничивается явлением диффузии, а деградация под действием микроорганизмов исключается. Как и для ферментов, заключенных в гелевую матрицу, использование высокомолекулярного субстрата не представляется возможным, вследствие того, что он не сможет пройти через полупроницаемую мембрану носителя.

Химические методы. При использовании химических методов иммобилизации между ферментами и носителем возникают ковалентные связи. Ковалентные связи образуются за счет того, что ферменты, являясь веществами белковой природы, содержат на поверхности молекулы различные функциональные группы: гидроксильные, карбоксильные, тиоловые, амино-, имидазольные, гуанидиновые и т.д. Самые реакционные - это SH-группы, принимающие участие в реакциях окисления, ацилирования, алкилирования и др. Эти группы играют большую роль в стабилизации белка-фермента при помощи дисульфидных мостиков. Так как сульфгидрильные группы входят в активный центр многих ферментов, их не используют для иммобилизации, а, напротив, защищают. В качестве группы - мишени при химической иммобилизации чаще всего используют высокореакционные аминогруппы белка, которых достаточно много и роль которых в поддержании структуры фермента второстепенна. Ковалентная иммобилизация ферментов позволяет получать препараты с заданными и контролируемыми свойствами, но, вследствие дороговизны и сложности получения таких биоматериалов, их производство и применение в крупных масштабных ограничено.


Свойства иммобилизованных ферментов

Ферменты испытывают на себе влияние окружающей среды, поэтому окружить фермент нерастворимым полимером - это модифицировать его свойства. Например, полимерная матрица, к которой прикреплен фермент, может препятствовать проникновению к ферменту субстрата или выходу в среду продуктов реакции или же она, надежно «прикрывая» фермент, лишает его подвижности, необходимой для выполнения каталитических функций. Таким образом, свойства иммобилизованных ферментов связаны с влиянием полимерной матрицы на «микроокружение» фермента и непосредственно на его активность, а также с различными эффектами, воздействующими на реальное поведение катализатора (термин «микроокружение» используется для наименования среды внутри полимерной матрицы). Обычно активность фермента регистрируют по изменению рН, концентрации субстрата и продукта и т.д. в среде («макроокружении» фермента). В «микроокружении» эти же параметры могут иметь другие значения. Влияние полимерной матрицы на «микроокружение» связано с эффектом распределения и с диффузионными ограничениями. Эффект распределения является следствием того, что полимер либо притягивает, либо отталкивает от своей поверхности субстрат, продукт реакции, ингибитор или активатор и различные ионы, тем самым повышая или понижая их концентрацию в растворе, в результате чего их содержание вокруг фермента и во всей системе будет отличаться. Определенную роль в создании эффекта распределения играют также гидрофобные взаимодействия растворенных веществ с полимерной основой, специфические реакции между носителем и растворенным веществом и т.д.

В процессе иммобилизации может быть затронута пространственная структура фермента. Если это связано с химической модификацией функциональных групп белка, то для предотвращения такого явления необходимо либо защищать эти группы в ходе иммобилизации, либо подбирать такие методы, которые не затрагивают эти группы. Когда причиной нарушения конформации фермента являются неспецифические взаимодействия между ферментом и носителем (образование электростатических, гидрофобных и водородных связей), то, либо, с помощью сшивающего агента отделяют молекулу фермента от поверхности носителя, либо заменяют носитель на инертный по отношению к катализатору. Иммобилизация повышает устойчивость фермента к внешним воздействиям, что связано с рядом факторов: концентрацией субстрата, ограничением его диффузии и т.д.. Вследствие высокой локальной концентрации фермента и диффузионных ограничений при проникновении субстрата в гель, весь субстрат, проникший в гелевую ячейку, может быть «переработанным» даже тогда, когда часть молекулы фермента будет «инактивирована» (например, тепловой обработкой) и т.д.

В ряде случаев иммобилизация приводит к снижению ферментативной активности. Причиной такого явления могут быть стерические ограничения, возникающие в том случае, когда иммобилизация каким-то образом мешает доступу субстрата и эффектора в полимерную матрицу. Для устранения таких ограничений используют водорастворимые носители с небольшой молекулярной массой, проводят деградацию носителей различными агентами и т.д., не изменяя первичную структуру и пространственную организацию иммобилизованного фермента. Стерические ограничения могут возникнуть вследствие "эффекта неправильного связывания", когда в процессе иммобилизации активный центр фермента блокируется полимерной матрицей. Инактивация фермента только через активный центр (без конформационных сдвигов) может возникнуть при проведении процесса иммобилизации в жестких условиях - высокое значение рН, присутствие свободных радикалов или окисляющих агентов и другие.

Установлено, что изменение исходных или эффективных параметров ферментов (распределение протонов) при иммобилизации приводит к модификации их рН-зависимости. Эти явления обусловлены либо воздействием полиионных матриц на распределение протонов, либо ограничением диффузии протонов полимерной матрицей. Способность вызывать перераспределение протонов между фазой свободного раствора и микроокружением фермента является общим свойством полиионных матриц, обусловленным присутствием заряженных (ионизированных) групп. При этом полианионы стремятся сконцентрировать протоны, снижая при этом рН вокруг иммобилизованного фермента, тогда как поликатионы обычно отталкивают протоны, повышая тем самым рН. Полимерная матрица, на которой иммобилизован фермент, может препятствовать свободной диффузии протонов, что особенно заметно с возрастанием рН. Протоны же, в отличие от большинства других продуктов биохимических реакций, влияют на активность фермента даже в том случае, если их концентрация очень низка. Поэтому при определении рН-чувствительности иммобилизованного фермента необходимо учитывать тот факт, что в «микроокружении» значение рН может отличаться от такового в «макроокружении» [37].

Иммобилизация вызывает изменение активности ферментов (в частности, величины К_м) вследствие вариаций свойств микроокружения. Например, когда молекулы фермента окружены не перемешиваемым слоем растворителя (слой Нернста), в котором концентрация субстрата ниже, чем в основной массе раствора, для насыщения иммобилизованного фермента требуется более высокая концентрация субстрата. На величину К_м может оказывать влияние ионная природа носителя, в частности, если субстрат заряжен. Уменьшение К_м при иммобилизации дает дополнительные практические преимущества, поскольку при низких концентрациях субстрата скорость реакции будет выше, чем в случае свободного фермента. Увеличение К_м, напротив, означает, что для достижения данной скорости реакции требуется большая концентрация субстрата, чем для свободного фермента. На активность иммобилизованных ферментов, как и в случае свободных, могут оказывать влияние низко- и высокомолекулярные вещества, субстраты и продукты реакции. Любая полимерная матрица, затрудняющая свободную диффузию субстрата, ограничивает и свободную диффузию продукта, в результате чего концентрация продукта в «микроокружении» будет больше, чем в свободном растворе, и он будет ингибировать ферментативную реакцию.

В основе технологичности иммобилизованных ферментов лежит их высокая стабильность. Известно, что инактивацию ферментов вызывают различные физические (температура, облучение, ультразвук и др.) и химические факторы, в основе действия которых лежат следующие молекулярные механизмы: а) агрегация за счет водородных связей и гидрофобных взаимодействий; б) изменение первичной структуры в результате разрывов в полипептидной цепи и модификация функциональных групп фермента в результате их окисления, расщепления дисульфидных связей, фосфорилирования, дезаминирования и т.д.; в) диссоциация олигомерных белков-ферментов на субъединицы при действии детергентов, мочевины, температуры и т.д. Одними из наиболее удобных полимерных материалов для иммобилизации ферментов являются заряженные полиэлектролиты благодаря эффективному электростатическому взаимодействию компонентов, а также возможности варьировать как знак, так и плотность заряда на поверхности комплекса. Несмотря на большое число публикаций по образованию комплексов между двумя (анионным и катионным) полиэлектролитами, одним полиэлектролитом и ПАВ, белком и противоположно заряженным полиэлектролитом [24, 38, 28-37], задача иммобилизации ферментов в комплекс из двух противоположно заряженных полиэлектролитов с образованием трехкомпонентной системы является важной и актуальной.