Эпизоотологический мониторинг и иммунопрофилактика классической чумы свиней и болезни ауески 16. 00. 03 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Вид материала

Автореферат

Содержание 2.2.3 Отработка оптимальных условий получения высокоактивного вируссодержащего материала вируса классической чумы свиней 2.2.4 Определение оптимальных параметров культивирования вируса болезни Ауески в культурах клеток 2.3 Изучение иммуногенной эффективности вирусвакцин против классической чумы свиней и болезни Ауески 2.3.2 Изучение сохранения иммунобиологических свойств вирусов классической чумы свиней и болезни Ауески, пассированных в культур 2.3.3 Антигенная и иммуногенная активность вакцинных вирусов классической чумы свиней и болезни Ауески, при их ассоциированном п 2.3.4 Влияние электростимуляции на выработку иммунитета 2.4 Изучение устойчивости вирусвакцин против классической чумы свиней и болезни Ауески при хранении

Подобный материал:

• Иммунный статус поросят при пневмонии, вызванной вирусом репродуктивно-респираторного, 398.05kb.
• Функциональная и рецепторная характеристика белков суперсемейства иммуноглобулинов, 1127.13kb.
• Совершенствование системы ветеринарно-профилактических мероприятий и её влияние, 471.82kb.
• Темы рефератов для поступления в аспирантуру по научной специальности 06. 02. 02 ветеринарная, 14.27kb.
• Кудряшова жанна Алексеевна Теоретические и практические аспекты новых подходов профилактики, 392.23kb.
• Оптимизация системы контроля эпизоотического процесса некробактериоза крупного рогатого, 1086.61kb.
• Программа вступительного экзамена в аспирантуру по специальной дисциплине 06. 02., 270.79kb.
• Получение и использование моноклональных антител в диагностике гриппа птиц 16. 00., 455.11kb.
• Терапевтическая эффективность гинодиксина при эндометритах и маститах у коров, вызванных, 301.79kb.
• Резервуары лиссавирусов на территориях, стационарно неблагополучных по бешенству 16., 223.09kb.

2.2.3 Отработка оптимальных условий получения высокоактивного вируссодержащего материала вируса классической чумы свиней

Для получения активной вирусной массы вначале подбирали биологические модели культивирования. С этой целью проводились попытки по адаптации лапинизированного штамма «КТ» к культурам клеток РК-15, ТЯ, ТП, обработанных ПЭГ-6000. Культивирование вируса проводили стационарным, роллерным методами и методом пересева инфицированного пласта клеток. В каждой культуре клеток каждым способом проведено 10 адаптационных пассажей. При этом длительность цикла культивирования продолжалась 96-120 ч, а иногда более. В итоге получены различные варианты вируссодержащей суспензии, проверка иммуногенных свойств которых показала ее отсутствие. Поэтому в дальнейших экспериментах изучали накопление штамма вируса КЧС Pestis suum «КТ» в организме кроликов. Исследования были направлены на определение периода сбора вируссодержащего материала, обеспечивающего максимальное накопление вируса. При инфицировании лапинизированным штаммом «КТ» кроликов весом 2,5-3 кг было обнаружено, что, начиная со вторых суток, у них проявляется гипертермия (от 39,6^оС до 42^оС), которая продолжается на протяжении от 1 до 2 суток. В результате были определены инфицирующая доза штамма «КТ» для кроликов (не менее 10^2,0 ИД_50/гол), сроки убоя кроликов для получения вируссодержащего материала (3 суток после инфицирования), при этом температура кроликов должна быть не ниже 40ºС, при которой необходимо проводить их убой для получения материала. Кроме того, отрабатывались и другие приемы и параметры технологии приготовления вакцины (замораживание органов кролика, взятых в качестве вирусного материала при температуре минус 40ºС), промывка рабочим солевым раствором сгустков фибрина для большего извлечения вируса, режим измельчения органов кроликов (кишечные лимфоузлы, селезенка), степень разведения полученной суспензии, режим центрифугирования для отделения измельченных тканей. Активность вакцины, полученной в конечном итоге, при титровании на кроликах оказалась 10^4.0 ИД₅₀. Подкожное введение препарата подсвинкам живым весом 30-35 кг в разведениях 1:10 и 1:100 не вызывало у последних каких–либо клинических признаков заболевания и других нежелательных отклонений от физиологических норм. Проверка стерильности показала, что она является свободной от посторонней микрофлоры и плесени. Контрольное заражение подсвинков, привитых вакциной в разведении 1:100 на 21 сутки после введения препарата вирулентным штаммом Ши-Мынь вируса КЧС показало, что испытуемая вакцина является иммуногенной и предохраняет свиней от КЧС.

Таким образом, получение активного вируссодержащего сырья (кровь, селезенка, лимфоузлы) штамма вируса КЧС Pestis suum «КТ» предусматривает проведение сбора вируссодержащего материала с 28 часа до 72 час после заражения кроликов. Биологическая активность штамма в готовом продукте составляет 3,75-4,5 lgИД_50/см³.


2.2.4 Определение оптимальных параметров культивирования вируса болезни Ауески в культурах клеток

С целью выбора оптимальных условий культивирования вируса БА штамм «УБ-95», нами изучены степень его накопления в различных культурах клеток и цитопатическая активность в процессе пассирования в культурах клеток. С целью определения стабильности свойств и возможности использования генераций культуры клеток ФКЭ разного пассажного уровня изучали культральные свойства штамма, а также влияние питательных сред на накопление вируса в культурах клеток. Указанные исследования позволили осуществить выбор оптимального клеточного субстрата, питательной среды и способа культивирования клеток и вируса для получения сравнительно активных вируссодержащих масс штамма «УБ-95».

Из всех испытанных культур клеток наиболее чувствительными к штамму «УБ-95» оказались первичные культуры клеток ФКЭ, ПК и перевиваемые клетки ВНК-21. ЦПЭ вируса в указанных культурах клеток проявлялась через 20-24 часа, после их инфицирования и через 36-48 часов поражалась большая часть (80-90%) площади клеточного монослоя. Цитопатическая активность вируса, полученного в указанных культурах клеток, варьировала в пределах 10^8,00 - 10^8,33 lgТЦД_50/СМ³. Культуры клеток ТЯ, ПЯ, ПП, ПО, РК-15, СПЭВ обладали сравнительно меньшей чувствительностью к вирусу БА. Вирус в них накапливался в титре от 10^5,25 до 10^7,25 lgТЦД_50/СМ³ в течение 48-96 ч.

Таким образом, исследования показали возможность получения активного вирусного сырья штамма «УБ-95» в культурах клеток ФКЭ, ПК и ВНК-21 с использованием питательной среды ПСП.

Результаты исследований по изучению размножения вируса в субкультуре клеток КФ разного пассажного уровня позволили заключить, что для получения сравнительно активных вирусных материалов штамма «УБ-95» (с титром не ниже 10^8,0ТЦД₅₀/см³) можно использовать не только первичную культуру клеток ФКЭ, но и их субкультуры 1-10 пассажей. Оказалось, что клетки субкультур по сравнению с первичными, значительно активнее пролиферируют и быстрее формируют клеточный монослой.

С целью определения оптимальных условий культивирования штамма «УБ-95» вируса БА проведены исследования с использованием линии клеток ВНК-21 при роллерном, стационарном, суспензионном, роллерно-суспензионном способах с целью определения метода, который обеспечивал бы максимальный выход вируса при минимальных затратах времени и средств. Множественность инфицирующей дозы в опытах составляла 0,01-0,1 ТЦД_50/кл. В результате, при суспензионном и роллерно-суспензионном способах, титры вируса были сопоставимыми и колебались в пределах 8,00-8,25 lgТЦД₅₀/см³, при сроках сбора вируса через 24-36 ч. после инфицирования. При стационарном культивировании титр вируса был пределах 7,75-8,00 lgТЦД₅₀ /см³, при сроке культивирования 36-48 ч.

Таким образом, при сравнении роллерного, стационарного, суспензионного и роллерно-суспензионного способов культивирования в наибольших титрах вирус накапливается при роллерном способе, уровень накопления вируса в суспензии и стационарных однослойных культурах приблизительно одинаков.


2.3 Изучение иммуногенной эффективности вирусвакцин против классической чумы свиней и болезни Ауески

2.3.1 Иммунобиологические свойства вирусвакцин против классической чумы свиней и болезни Ауески

Иммуногенную активность вирусвакцин против КЧС и БА изучали на подсвинках и овцах. С этой целью вакцинировали подсвинков в дозах 100, 500, 1000, 5000 ИД₅₀ вакциной против КЧС внутримышечно и в дозах 50, 100, 1000, 10000, 100000 ТЦД₅₀ вакциной против БА, подкожно. Через каждые 7 суток после вакцинации и перед контрольным заражением собирали сыворотки крови для определения антител к вирусу КЧС в ИФА и антител к вирусу БА в РН.

Через 21 сутки после вакцинации всех животных опытной группы и по 2 интактных (контрольных) подсвинков и овец подвергали контрольному заражению вирулентным вирусом путем внутримышечного введения штамма «Ши-Мынь» вируса КЧС и штамма «Кордай» вируса БА.

У всех привитых вакциной против БА были обнаружены вируснейтрализующие антитела в титрах от 1:2 до 1:16 в различные сроки после вакцинации, за исключением тех случаев когда животных прививали в дозе 100 ТЦД50, у которых через 7 суток после вакцинации нейтрализующие антитела не были выявлены. У животных, вакцинированных в дозе 50 ТЦД₅₀, не были установлены нейтрализующие антитела во все исследуемые сроки. В связи с тем, что вакцинированные подсвинки не реагировали на контрольное заражение, то иммуногенность для свиней оценивали по корелляции между титрами ВНА у иммунизированных овец и подсвинков, которые были сопоставимы. Данные контрольного заражения показали, что животные, вакцинированные в дозах 100, 1000, 10000, 100000 ТЦД50, устойчивы к вирулентному вирусу, в то время как животные контрольной группы (овцы) заболевали БА и погибли с характерными клиническими признаками болезни к 7-10 суткам наблюдения, как и овцы, привитые в дозе 50 ТЦД50.

Результаты ИФА с вирусом КЧС показали, что в сыворотке крови опытных животных титры антител составили по степени потенциальной инертности более 50% на 5-7 сутки. При контрольном заражении вирулентным вирусом КЧС подсвинки оказались устойчивыми к заболеванию.

Другую важную характеристику вакцины - безвредность, определяли путем подкожного введения животным вирусвакцин в объеме 5 мл с титром 3,5-4,25 ИД_50/см³ вируса КЧС и 8,0-8,50 lg ТЦД_50/см³ вируса БА. В течение 14-21 суток вели клиническое наблюдение за животными.

Результаты исследований показали, что животные не реагировали на введение повышенных доз вирусвакцин. Исключение составляла группа животных, привитая вакциной против БА в дозе 5х10^8,0-8,5 lg ТЦД_50/см³. Животные данной группы реагировали кратковременной лихорадкой и образованием припухлостей в месте введения препарата диаметром 1-2 см, которые исчезли к 7-10 суткам.

Полученные сведения позволяют утверждать, что вакцины против КЧС и БА, слабореактогенны и безвредны для подсвинков и овец.

Результаты экспериментов по определению сроков наступления иммунитета показали, что у животных, привитых в дозе не менее 500 ИД₅₀ против КЧС и 10 000 ТЦД₅₀, вирусвакциной против БА, изготовленной в культурах клеток ФКЭ и ВНК-21 иммунитет вырабатывается на 5 сутки после вакцинации достаточно высокой напряженности, которая продолжается до 150 и 360 суток, соответственно (срок наблюдения).

При изучении иммунобиологических свойств вирусов, необходимы были периодические исследования крови на наличие факторов клеточного и гуморального иммунитета. Использованные традиционные методы отбора проб крови из ушной и хвостовой вен животных не всегда были продуктивными и требовали затраты значительного времени и труда. Поэтому для облегчения указанного процесса нами разработана полезная модель «Станок для фиксации свиней». Эксперименты показали, что использование данной полезной модели обеспечивает взятие крови и проведение кастрации подсвинков со значительной производительностью труда. На данную полезную модель получен предварительный патент №54353 от 25.02.2008.

Разработанная полезная модель нашла применение в производственных условиях, в хозяйствующих субъектах Акмолинской и Павлодарской областей.


2.3.2 Изучение сохранения иммунобиологических свойств вирусов классической чумы свиней и болезни Ауески, пассированных в культурах клеток и кроликах

Результаты исследований показали, что овцы, привитые штаммом «УБ-95» вируса КЧС 1 и 5 пассажей в культуре клеток ВНК-21, 1 и 15 пассажей - в культуре клеток КФ, были устойчивы к контрольному заражению через 7 суток после вакцинации, в то время как животные контрольной группы заболели с ярко выраженными клиническими признаками БА.

Результаты ИФА с вирусом КЧС 5 пассажа показали, что в сыворотке крови опытных животных титры антител через 5 и 14 суток после вакцинации составили по степени потенциальной инертности >50%, что свидетельствовало о выработке иммунитета сравнительно высокой напряженности.

Таким образом, вирус БА штамма «УБ-95» сохраняет свои основные биологические свойства (цитопатическую активность, иммуногенные и антигенные свойства) в течение 5 последовательных пассажей в культуре клеток ВНК-21 и в течение 15 - в культуре клеток КФ (срок наблюдения). Вирус КЧС штамма «КТ» сохраняет свои основные биологические свойства (иммуногенные и антигенные свойства) в течение 5 последовательных пассажей в организме кроликов.

2.3.3 Антигенная и иммуногенная активность вакцинных вирусов классической чумы свиней и болезни Ауески, при их ассоциированном применении

Целью исследований явилось изучение антигенной и иммуногенной активности вакцин против БА и КЧС при их ассоциированном применении.

Для иммунизации использовали вакцину против БА из штамма «УБ-95», полученную в ФКЭ и вакцину против КЧС из штамма «КТ». Вакцинные вирусы перед применением смешивали в равных соотношениях, разводили 1:100 физиологическим раствором и в объеме 2 см³ вводили внутримышечно двум подсвинкам в возрасте 4-5 месяцев, невакцинированных против БА и КЧС. Антигенную и иммуногенную активности вирусвакцины против БА определяли по вируснейтрализующим антителам в сыворотке крови привитых животных до и через 21 сутки после вакцинации. Антигенную и иммуногенную активность вакцины против КЧС - по результатам ИФА. Реактогенность ассоциированной вакцины оценивали по общему состоянию привитых животных, температуре тела и состоянию мест инъекций.

Результаты исследований проб сыворотки крови (таблица 3) показали, что у вакцинированных ассоциированным препаратом животных выработка антител против БА была в пределах 1:4-1:8, что в принципе соответствует титрам поствакцинальных антител, образующихся при моновакцинации.

Данные ИФА с вирусом КЧС показали, что в сыворотке крови опытных животных титры антител через 21 сутки составили по степени потенциальной инертности >50%.

Использование вакцинных вирусов против БА и КЧС в ассоциации не вызывали каких либо видимых клинических реакций со стороны привитых животных. Температура тела подсвинков оставалась в пределах физиологической нормы, патологии общего состояния и вместе инъекции не было выявлено.


Таблица 3 – Титры специфических антител на вирусы БА и КЧС в сыворотках крови вакцинированных животных

Животные	Сроки исследования
Подсвинки 4-5 мес. возраста	до вакцинации		на 21 сутки после иммунизации
	на ВБА	на ВКЧС	на ВБА	на ВКЧС
	РН	ИФА*	РН	ИФА*
	н/о	н/о	1:8	овцы
	н/о	н/о	1:16	>50
Примечание: н/о – вируснейтрализующие антитела не обнаружены; *ИФА – по степени потенциальной инертности.

Таким образом, ассоциированное применение вирусвакцин против БА и КЧС, обеспечивает выработку иммунитета не уступающего по титрам при их раздельном применении.


2.3.4 Влияние электростимуляции на выработку иммунитета

В настоящее время все большее применение в медицине и ветеринарии получают нетрадиционные методы, используемые для профилактики и лечения болезней (электростимуляция, ДиаДЭНС-терапия и т.п.).

В своих исследованиях мы изучили возможность использования электростимуляции для повышения иммунного ответа животных на введение вирусвакцины. Опыты проводили в два этапа: подготовительный (до электростимуляции) и учетный (после электростимуляции). В подготовительный период овец в возрасте 12-16 мес. в количестве 6 голов, массой 35-50 кг, исследовали клинически, с ежедневным двукратным измерением температуры тела, подсчетом частоты дыхания и оценкой иммунологических показателей организма по общему количеству лимфоцитов, количеству Т и В клеток, хелперных и супрессорных популяции Т-клеток и фагоцитарной активности мононуклеаров.

Электростимуляцию проводили импульсным током прямоугольной формы, частотой 500 Гц, продолжительностью импульсов 0,5 м/с, при силе тока 14 мА в течение 10 минут с помощью аппарата ГИ-1 конструкции Н.Я. Начатова и В.В. Комарова (1978), с использованием биаурикулярных электродов для овец конструкции Ю.В. Хромова (1985).

Животных фиксировали в лежачем положении на правом боку. Электроды перед наложением обворачивали марлей, смоченной 1%-ным раствором хлорида натрия. До электростимуляции было проведено контрольное исследование у 3-х овец, далее по плану проводили учет иммунологических показателей на 7, 21, 60 день. Кровь брали из яремной вены утром, перед кормлением.

Результаты определения наличия вируснейтрализующих антител, показали, что в сыворотках крови вакцинированных животных, а также подвергнутых электростимуляции в исследуемые промежутки времени, титры были в пределах 1:2-1:4 через 7 суток, 1:4-1:32 через 21 суток, 1:4-11:16 через 60 суток. Полученные результаты свидетельствуют о том, что данные титры сопоставимы с титрами антител, которые обнаруживались у животных при изучении иммунобиологических свойств препарата.

Электростимуляция обуславливала развитие у животных Т-лимфоцитопении. Количество В-клеток, имеющих рецепторы к FcIgG, после вакцинации снижалась, у животных 1-й группы на 33%, а у 2-й - на 28%. При этом количество В-лимфоцитов, имеющих рецепторы к СЗ, после вакцинации уменьшалось в 2 раза, а в случае электростимуляции - на 25%. Фагоцитарный индекс во 2-й группе овец через неделю после вакцинации уменьшился в 2,5 раза, а в 1-й группе - в 1,8 раз. На 21-й день эксперимента, когда синтез антител находится на «плато», различий между показателями, характеризующими Т- и В-звенья системы иммунитета, факторов неспецифической защиты в сравниваемых группах не наблюдалось. У овец 2-й группы на 60-й день отмечается лейкопения, при этом уровень клеток был снижен на 24%. Необходимо отметить, что содержание Т-лимфоцитов у овец было уменьшено в 2-х группах в 1,6-1,7 раза. Причем количество Т-клеток с хелперной активностью во 2-й группе снижалось на 46%, а в 1-й - на 31%, лимфоцитов с цитотоксической и супрессорной активностью соответственно – в 1,6 и 2,7 раз. Если электростимуляция не приводила к уменьшению уровня В лимфоцитов после вакцинации, то у овец 2-й группы количество клеток имеющих рецепторы к СЗ, на 60-й день эксперимента снижалось в 1,5 раза.

На основании вышеизложенного установлено, что электростимуляция не оказывает влияния на выработку гуморальных факторов иммунитета. Титры антител были сопоставимы с титрами антител, которые обнаруживались у животных при иммунизации без данного воздействия. Для стимуляции выработки эффекторов клеточного иммунитета предлагается проводить электростимуляцию на 3-й день после вакцинации (первичного введения антигена) - «эффект третьих суток», либо назначать дополнительно животным препараты, влияющие на Т-звено иммунной системы.


2.4 Изучение устойчивости вирусвакцин против классической чумы свиней и болезни Ауески при хранении

2.4.1 Устойчивость нативных вариантов вирусвакцин против классической чумы свиней и болезни Ауески при хранении

С целью изучения устойчивости нативных форм штамма УБ-95 вируса БА, выращенного в культуре клеток ВНК-21 несколько партий вируссодержащего материала хранили при температурах 37+0,5°С; 20-25°С; 0-4°С и минус 40°С. Через различные интервалы времени из каждой партии брали пробы и определяли остаточную активность вируса титрованием в культуре клеток. Активность нативного вируса при температуре 37+0,5ºС не изменялась в течение первых двух суток. Через трое суток хранения при указанной температуре активности вируса понизилась в среднем на 0,25-0,50 lg ТЦД50/см³, через 5 суток – 1,0-1,25 ТЦД50/см³, через 7 суток – 1,50-1,75 lgТЦД50/ см³, через 10 суток – 2,50-2,75 lg ТЦД50/см³, через 14 суток – 3,75-4,0 lg ТЦД50/см³.

В процессе хранения вирусного материала при температуре минус 40^°С, в течение 18 месяцев не наблюдалось снижение его биологической активности. При температуре 0-4^°С также не происходило снижение активности вируса в течение 2 мес. хранения, только через 6 мес. при данной температуре она снизилась на 1,50-1,75 lgТЦД50/см³, а через 12-18 мес. снижение активности составило 2,50-3,75 lgТЦД50/см³. При температуре хранения 20-24°С не отмечена потеря титра вируса в течение первых 5 суток. Снижение активности вируса через 1 мес. хранения составило 0,25-0,50 lg ТЦД50/см³, через 3 мес. – 1,25-1,50 lg ТЦД50/см³, через 6 мес. – 2,50-2,75 lg ТЦД50/см³ и через 12 мес. – 4,75-5,00 lg ТЦД50/см³.

Таким образом, в случае возникновения необходимости возможно сохранение нативного вируса штамма «УБ-95» при температурах минус 40ºС в течение 18 мес., 0-4°С – в течение 2 мес. без снижения его исходной активности.

С целью подбора защитной среды, обеспечивающей наибольшую стабильность в процессе лиофилизации и последующем хранении, были приготовлены микросерии вакцин из вирусных суспензий, полученных в культуре клеток ВНК-21, в смеси с различными стабилизирующими добавками (6 прописей). Предварительно были определены титры вируса до и после лиофилизации, а после этого сухие образцы закладывали на хранение при температуре 37+0,5°С.

Через определенные промежутки времени пробы для определения биологической активности титровали общепринятым методом. Результаты проведенных опытов показали, что в процессе лиофилизации лучшая сохраняемость вируса была в образцах вакцины №1 – пептон-лактоза (3,0%, 2,5%) и №3 – сухое обезжиренное молоко (2%). В течение 45 суток (конечный срок наблюдения) хранения установлено, что наилучшее сохранение вируса наблюдается в образцах вакцины № 1 и 3 (снижение титра было в пределах 1,5-1,75 lgТЦД50/см³). В других образцах вакцины снижение активности было наибольшим (2,5-3,25 lgТЦД50/см³), в контрольном образце инактивация вируса была в пределах 4,0 lgТЦД50/см³.

При температуре хранения 37+0,5°С снижения титра вируса КЧС штамм «КТ» в первые 5-7 суток не отмечено. А через 1 мес. хранения при данной температуре титр вируса снизился на 0,50 lg ТЦД50/ см³, через 3 мес на 1,0-1,25 lg ТЦД50/см³, через 6 мес на 2,0-2,5 lg ТЦД_50/см3.

Результаты изучения устойчивости лиофилизированных вариантов вирусвакцин против классической чумы свиней и болезни Ауески при хранении показали, что активность вакцин, восстановленных из сухого состояния до рабочего разведения существенно не изменяется в течение суток при температуре 37+0,5ºС, через 3 суток снижение титра вируса при указанной температуре составило 0,75-1,0 lg ТЦД50/см³, через 7 суток - 2,0-2,25 lgТЦД50/см³ и через 14 суток - 2,50-2,75 lgТЦД50/см³. При температуре 20-25ºС снижение активности вируса в течение 3 суток было незначительным (до 0,25 lgТЦД50/см³), через 7 суток в пределах 0,75-1,0 lg ТЦД50/см³, через 14 суток - 1,25-1,50 lgТЦД50/см³. При температуре 0-4ºС снижение активности вируса не наблюдали в течение 3 суток хранения, через 7 суток снижение активности вируса было незначительным (0,25 lg ТЦД50/см³) и через 14 суток до 0,5-0,75 lg ТЦД50/см³, по сравнению с исходной.

Таким образом, вакцины из штамма «КТ» против КЧС и штамма «УБ-95» против БА, восстановленные физиологическим раствором из сухого состояния до рабочего разведения, можно хранить и использовать без существенного снижения активности при температуре 37+0,5ºС - в течение суток, при температуре 0-4ºС - 5-7 суток, а при температуре 20-25ºС – 1 сутки.