Анализ комплексов лактоферрина молока человека
Дипломная работа - Химия
Другие дипломы по предмету Химия
взаимодействует со многими широко распространенными сорбентами, используемыми для гель-хроматографии. Сотрудниками ЛФР ИХБФМ в результате анализа ряда сорбентов было показано, что наиболее оптимальным для анализа ЛФ c помощью метода гель-хроматографии является Sepharose 4B. Этот сорбент слабо взаимодействует с ЛФ и относительное время выхода олигомерных форм ЛФ при гель-хроматографии соответствует их относительным молекулярным массам. Учитывая это, в данной работе был проведен анализ относительного содержания олигомерных форм ЛФ, инкубированного в различных условиях, с помощью гель-хроматографии. Для оценки относительной массы олигомерных форм ЛФ сначала была проведена гель-хроматография контрольных белков с известной мол. массой и калибровочная кривая.
Рис. 9. Калибровочная кривая для оценки мол. масс белков, полученная с использованием белков с известными мол. массами: ЧСА (67), IgG (150 кДа), IgA (400 кДа), IgM (800 кДа)
Следует отметить, что точное определение мол. масс небольших пиков белка около 800 кДа и более сильно затруднено, так как при таком малом времени выхода, значительными становятся такие факторы как ширина пика, а так же объем и время нанесения пробы на сорбент. Кроме того, Sepharose 4B обладает плохой эффективностью разделения белков с мол. массами ? 800 кДа. Учитывая это, далее следует считать, что фракции ЛФ, кажущиеся мол. массы которых оценены приблизительно как 780, 800 кДа и более (но не меньше) могут иметь и значительно большую мол. массу, или быть смесью нескольких субфракций белка, мол. масса которых превышает 780 кДа. В то же время пик декамера, соответствующий 754 кДа (см. ниже), скорее всего, можно считать определенным с более высокой точностью ввиду его малой ширины и хорошей высоты пика белка, а так же существенного удаления от характерного места выхода небольших по размеру пиков более 780 кДа.
На рис. 10 приведен профиль оптической плотности, соответствующей гель-хроматографии лактоферрина, инкубированного в 50 мM Трис-HCl, рН 7.5, а так же после инкубации ЛФ в этом же буфере, содержащем, 0,1 и 0,15 КСl. Видно, что ЛФ, инкубированному в буфере без соли, соответствует большой пик с кажущейся мол. массой 275 кДа с двумя плечами в области 295 и 251 кДа. Кроме того, видны пики в области ?145 кДа и относительно маленький по величине пик в области примерно 780 кДа.
Добавление к раствору ЛФ 0,1 М КСl ведет к очень сильному уменьшению пика с мол. массой 275 кДа и резкому увеличению пиков с мол. массами 145 и 68 кДа. Одновременно происходит уменьшение высокомолекулярного пика в области 780 кДа. Увеличение концентрации КСl до 0,15 М приводит к еще более сильному перераспределению относительного количества ЛФ в указанных пиках. После инкубации ЛФ с 1 М КСl обнаружен только один пик белка, элюируемый в области 68 кДа.
Рис. 10. Анализ олигомерных форм ЛФ с помощью гель-хроматографии. Приведены профили оптического поглощения при 280 нМ (А280) препаратов ЛФ, инкубированных в разных условиях. Перед гель-хроматографией ЛФ инкубировали в 50 мM Трис-HCl, рН 7.5 в отсутствие других лигандов (синяя кривая), в присутствии 0,1 M КСl (сиреневая кривая) или 0,15 M КСl (зеленая кривая)
При интерпретации полученных данных (рис. 10) следует принять во внимание следующие данные. Добавление КСl в инкубационную смесь, а также буфер, с помощью которого уравновешена колонка, должно приводить не только к диссоциации олигомерных форм ЛФ, но и уменьшению их взаимодействий с сорбентом. Кроме того, кажущиеся мол. массы белков при гель-хроматографии не всегда полностью соответствуют их истинным мол. массам, поскольку время выхода белков при гель-хроматографии зависит не только от мол. массы, но и от геометрической формы белковых глобул и их олигомеров. С учетом мол. массы мономера (76-80 кДа), молекулярные массы олигомерных форм белка должны быть равными: быть 152 - 160 кДа (димер), 228-240 кДа (тример), 304-320 кДа (тетрамер). Если учесть, что мономер с мол. массой 76 -80 кДа демонстрирует кажущуюся мол. массу примерно 68-70 кДа, то приблизительные мол. массы олигомеров могут быть близкими: 136 -140 кДа (димер), 204 - 210 кДа (тример), 272 - 280 кДа (тетрамер). Реально наблюдаемые значения мол. масс димера (145 кДа) и тетрамера (295-275 кДа) несколько ниже, чем вычисленные из значения истинной мол. массы мономера ЛФ, но в то же время немного больше, чем оцененные из значения кажущейся мол. массы мономера, найденной при гель-хроматографии. Особенно интересно, что пик при 275 кДа имеет два плеча при 295 и 251 кДа. По месту положения два из трех плохо разделенных пика могут соответствовать только тетрамерной форме ЛФ, в то время как третий пик с кажущейся мол. массой порядка 220 кДа может быть белковым тримером. Разделение тетрамерной формы белка на два пика может быть связано как с различной эффективностью взаимодействия различных тетрамерных форм ЛФ с сорбентом, так и возможностью различного типа укладки мономеров ЛФ при образовании тетрамера.
Как видно из рис. 11, согласно данным гель-хроматографии после инкубации ЛФ с олигосахаридом, белок в основном присутствует в растворе в виде мономера, димер проявляется в виде слабо выраженного плеча (150 кДа), небольшое количество ЛФ выходит в зоне тетрамера. Интересно, что добавление 0,15 М соли к раствору, содержащему олигосахарид, ведет к количественной димеризации белка, но уменьшению количества тетрамера.
В отсутствие соли, АТР лучше чем олигосахарид стимулирует образование димерной и тетрамерной форм ЛФ (рис. 12). Кроме того, становится заметным образование олигомера с мол. массой более 780 кДа. В то же врем