Анализ комплексов лактоферрина молока человека
Дипломная работа - Химия
Другие дипломы по предмету Химия
я, в нейтральном буфере в присутствии АТР образование тетрамера происходит в существенно меньшей степени.
Рис. 11. Анализ олигомерных форм ЛФ с помощью гель-хроматографии. Приведены профили оптического поглощения при 280 нМ (А280) препаратов ЛФ, инкубированных в разных условиях. Перед гель-хроматографией ЛФ инкубировали в 50 мM Трис-HCl, рН 7.5, с олигосахаридом в отсутствие (синяя кривая) и в присутствии 0,15 M КСl
Рис. 12. Анализ олигомерных форм ЛФ с помощью гель-хроматографии. Приведены профили оптического поглощения при 280 нМ (А280) препаратов ЛФ, инкубированных в разных условиях. Перед гель-хроматографией ЛФ инкубировали в 50 мM Трис-HCl, рН 7.5, с 50 мМ АТР в отсутствие (синяя кривая) и в присутствии 0,1 M КСl (сиреневая кривая)
Рис. 13. Анализ олигомерных форм ЛФ с помощью гель-хроматографии. Приведены профили оптического поглощения при 280 нМ (А280) препаратов ЛФ, инкубированных в разных условиях. Перед гель-хроматографией ЛФ инкубировали в 50 мM Трис-HCl, рН 7.5, с 50 мМ АМР в отсутствие (синяя кривая) и в присутствии 0,1 M КСl (сиреневая кривая) или 0,15 M КСl (зеленая кривая)
Особенно необычным оказалось поведение ЛФ в присутствии 50 мМ АМР. До добавления соли распределение различных форм ЛФ было сопоставимо с таковым для АТР, за исключением наличия декамерной (754 кДа) формы. Добавление 0,1 М KCl привело к резкому увеличению димерной формы ЛФ, практически полному исчезновению декамера, и исчезновению крупного олигомера с кажущейся мол. массой более 800 кДа (рис. 13). При этом, на профиле хроматографии появилась новая олигомерная форма ЛФ с мол. массой 359 кДа, соответствующая пентамеру. Повышение концентрации КСl до 0,15 М привело к разрушению пентамера и тетрамера и небольшому перераспределению ЛФ между димером и мономером.
С использованием данных гель-хроматографии были оценены массовые доли каждого из олигомеров, образующихся после инкубации ЛФ в различных условиях (табл. 5).
Таблица 5. Относительное содержание различных олигомерных форм ЛФ, образующихся при его инкубации в различных условиях, оцененное из данных гель-хроматографии
Условия образованияОлигомерная форма* мер**Декамер**МономерДимерТетрамерПентамерДекамерБуфер + 1 M NaCl100000000Буфер без соли37,51,760,8001,84,7Буфер +0,1 M KCl4,893,71,5002,05,2Буфер +0,15 M KCl4,095,50,58000,20,6Буфер (Б) + AMP***69,023,47,100,610,526,9Б + AMP + 0,1M KCl29,061,31,68,106,617,0Б +AMP + 0,15M KCl30,068,91,0004,210,8ATP60,136,83,0007,920,1Б +ATP + 0,1 M KCl76,121,12,8008,622,0Б+ATP + 0,15 M KCl39,058,92,2004,411,1Б+Олигосахарид93,45,41,2006,416,3Б +Oc + 0,1 M K Cl16,682,70,7001,53,9Б +Oc +0,15 M KCl12,687,40,030000
На основании данных Таблицы 5 можно выделить несколько закономерностей:
) Инкубация ЛФ в буфере, не содержащем КСl и других соединений основной формой белка является тетрамер.
) Добавление в раствор ЛФ 0,1 - 0.15 М КСl ведет к разрушению тетрамеров с образованием преимущественно димеров белка.
) В отсутствие соли ATP, АМР и олигосахарид стимулируют образование в основном мономерной формы белка, и в меньшей степени его димера. Добавление соли в присутствии этих лигандов стимулирует образование димерной формы ЛФ и уменьшение тетрамерной формы белка.
) В отсутствие соли только АМР стимулирует заметное образование декамера, а в присутствии 0,1 М КСl происходит образование необычной формы ЛФ, его пентамера.
Следует отметить, что пик белка, соответствующий олигомеру(ам) крупнее декамера (с мол. массой ? 780 -800 кДа) присутствовал в ряде реакционных смесей. Однако в случае анализа олигомерных форм ЛФ с помощью гель-хроматографии он был маленьким во всех случаях кроме АTР и 0,1 М KCl. Учитывая это, во всех случаях содержание этого пика было принято близким к 0. Скорее всего, этот олигомер является неустойчивым и разрушается во время хроматографии.
Следует отметить, что все олигомеры ЛФ являются не очень стабильными и легко разрушаются при добавлении соли. Кроме того, нельзя было исключить, что часть олигомерных форм ЛФ может разрушаться при гель-хроматографии, а взаимодействие молекул ЛФ с сорбентом может стимулировать диссоциацию комплексов белка. Поскольку некоторые пики, соответствующие высокоолигомерным формам, относительно маленькие, а их уменьшение может быть связано с перераспределением белковой плотности между пиками представляется в процессе хроматографии, корректная оценка содержания с помощью гель-хроматографии высокоолигомерных форм белка в растворе представляется не возможной. Одним из методов оценки относительных размеров белков непосредственно в растворе является метод СР. Как указывалось выше, олигомеры ЛФ, содержащие от 1 до 4 мономерных единиц белка, должны относительно слабо рассеивать свет. В то же время, именно олигомерные формы, содержащие больше 4 субъединиц белка, должны вносить максимальный вклад в СР.
3.2Анализ олигомеров ЛФ методом светорассеяния
В экспериментах по СР были использованы те же самые растворы ЛФ, что и для гель-хроматографии. Для каждого раствора были измерены индикатрисы СР (рис. 14). Экстраполируя индикатрисы СР к нулевому углу и пользуясь тем, что I(0)~N*M2, можно оценить среднеквадратичную молекулярную массу в каждой из смесей (рис. 15).
Рис. 14. Анализ светорассеяния олигомерными формами ЛФ, полученными в разных условиях. ЛФ инкубировали в 50 мM Трис-HCl, рН 7.5, содержащем 0,1 М КСl (кривая 1) и один из лигандов: 2 - 5 мМ олигосахарид, 3 - 50 мМ АТР, 4 - 50 мМ АМР
При получении данной оценки считалось, что ЛФ, инкубированный с олигосахаридом в 0,15 M KCl, имеет среднеквадратичную массу 145 кДа (согласно данным гель-хроматографии) и не содержит олигомерн?/p>