Анализ комплексов лактоферрина молока человека
Дипломная работа - Химия
Другие дипломы по предмету Химия
?х форм большего тетрамера.
Рис. 15. Значения корней среднеквадратичных масс для всех исследованных растворов ЛФ. Серии из трех столбиков диаграммы соответствуют: 1 - олигосахарид, 2 - ЛФ в отсутствии лигандов, 3 - АТР, 4 - АМР. В каждой из серий столбики соответствуют: 1 - ЛФ в отсутствие соли, 2 - в присутствии 0,1 M КСl, 3 - в присутствии 0,15 M КСl
Оцененная таким образом среднеквадратичная масса олигомерных форм ЛФ оказалась во всех случаях больше массы, оцененной с помощью гель-хроматографии, а в некоторых случаях она была больше массы тетрамера. Это означает, что долю крупных олигомерных форм, не учтенных при гель-хроматографии (или диссоциировавших в ходе хроматографии), можно оценить с помощью СР.
Очевидно, что при ассоциации могут образовываться различные олигомерные формы ЛФ, содержащие более 4-х мономерных единиц, которые будут рассеивать свет. По данным гель-хроматографии АМР стимулирует достоверное образование декамера, который в присутствии соли диссоциирует до пентамера. По приблизительным оценкам олигомеры с кажущейся мол. массой больше 800 кДа, которые наблюдаются в ряде случаев, могут быть примерно 16-мерами. К сожалению, оценка относительного содержания ассоциатов с разной степенью олигомеризации на основании полученных данных не представляется возможной. В то же время, можно оценить примерное содержание какого-либо одного высокоолигомерного ассоциата, если предположить, что данный ассоциат - единственный крупный олигомер (декамер и больше). На основании численных данных, приведенных на рис. 15, был проведен теоретический анализ возможного содержания 10-мерного и 16-мерного ассоциатов ЛФ в анализируемых растворах белка. Полученные данные приведены в табл. 5.
Интересно, что согласно проведенному анализу данных СР декамер может присутствовать во всех смесях ЛФ, кроме белка инкубированного в буфере, содержащем 1 М КСl. В данной модели анализ теоретического содержания крупных олигомеров проводился путем сравнения с наименее олигомеризованной смесью - ЛФ с олигосахаридом в 0,15 М КСl, т.е. считалось что в данном растворе олигомерный состав соответствует гель-хроматографии). При этом содержание декамера эффективнее всего стимулируется и регистрируется хроматографически только при добавлении АМР, затем (игнорируя содержание более крупных форм даже и зарегистрированных гель-хроматографией) АТР и хуже всего олигосахарида. Добавление 0,1 М КСl приводит к уменьшению содержания в растворе высокоассоциированных форм ЛФ, кроме ЛФ инкубированного с АTP, в котором олигомеризация повышается (согласно гель-хроматографии за счет крупного олигомера, при разрушении тетрамера).
В случае предположения о содержании в растворе только 16-мера ЛФ численные значения уменьшаются примерно в 2-3 раза, но общие закономерности те же самые (Таблица 5).
Таким образом, данные СР свидетельствуют в пользу того, что в растворе, в отсутствие других лигандов, а также в присутствии АТР и АМР может происходить образование высокоолигомерных форм ЛФ, которые, по-видимому, не стабильны и разрушаются в процессе гель-хроматографии на Sepharose.
ЛФ - конформационно активный белок, который может по-разному изменять свою структуру в присутствии лигандов разного типа. Поэтому различная эффективность образования олигомеров различной степени олигомеризации и стабильности, обнаруженные с помощью данных СР и гель-хроматографии (табл. 5) может свидетельствовать в пользу того, что под действием разных лигандов и в их отсутствии образуются олигомеры с разным типом организации. В пользу того, что олигосахарид, АТР и АМР стимулируют образование олигомеров ЛФ разного типа свидетельствуют данные о различной стабильности белковых ассоциатов, образующихся в присутствии этих лигандов. Так согласно данным СР, олигомерные формы ЛФ, образованные в присутствии АТР, разрушаются до мономеров в присутствии 50 мМ MgCl2 в течение 25 мин. в то время как АМР-зависимые комплексы в этих условиях достаточно стабильны (данные не приводятся).
С помощью индикатрис светорассеяния можно так же оценить средний радиус инерции для набора частиц, содержащихся в каждом из растворов. рис. 14 приведены данные по СР растворами ЛФ, инкубированными в различных условиях. С помощью уравнения Гинье средний радиус инерции (Rg) для ЛФ, инкубированного с ATP в присутствии 0,1 M KCl составил 41 3 нм, а для ЛФ инкубированного с AMP в 0,1 M KCl - 40 3 нм. Эти величины существенно больше величины Rg = 26.7 Е, найденного с помощью МУРР для мономера ЛФ. Поскольку основной вклад в СР вносят крупные по размеру частицы, то эти значения Rg можно считать нижней оценкой размеров крупных олигомеров.
3.3Анализ олигомеров ЛФ методом абляции
Одним из современных методов исследования мол. масс белков является МАЛДИ. Однако, этот метод исследования является достаточно жестким и при переходе нанесенных на носитель белков в газовую фазу происходит частичное разрушение белковых молекул. В связи с этим метод МАЛДИ не пригоден для исследования белковых олигомерных комплексов, в которых субъединицы обычно связаны слабыми нековалентными электростатическими, гидрофобными, Ван-дер-ваальсовыми взаимодействиями и водородными связями. Метод абляции различных соединений с твердых подложек существенно мягче, чем МАЛДИ, по условиям переведения соединений в газовую фазу. В настоящее время сотрудниками ИЦиГ и ИКХиГ СО РАН показано, что пероксидаза хрена может быть аблирована из лиофилизованного состояния и при э