Анализ комплексов лактоферрина молока человека
Дипломная работа - Химия
Другие дипломы по предмету Химия
адал минимальной способностью взаимодействавоть с ЛФ и его олигомерными комплексами. Хроматографию проводили с помощью хроматографа Biocad Sprint, снабженного перестальтическим насосом с мягкой подачей раствора на колонку. Раствор ЛФ (0,2 - 0,4 мл; 2-4 мг /мл) в в 50 мМ Трис-НСl буфере, рН 7,5, содержащем или несодержащем другие лиганды (до и после инкубации в различных условиях, см. выше) наносили на колонку Sepharose 4B (0,8 х 33 см), предварительно уравновешенную этим же буфером. Элюцию белков с сорбента проводили с помощью 50 мМ Трис-НСl буфера, рН 7,5, без соли или буфер содержал 0,1 или 0,15 М КСl. За выходом ЛФ следили по его поглощению на 280 нм. Для оценки мол. масс ЛФ и его комплексов с помощью метода гель-хроматографии использовали белки с известной мол. массой. Была получена калибровочная кривая, которая приведена ниже. Контрольные белки, как и ЛФ, наносили в объеме 0,1 - 0,3 мл в концентрации 1-3 мг/мл. Чувствительность детектора хроматографа равна 1Ч10-8 г/мл. Среднеквадратичное отклонение пиков при хроматографии препаратов ЛФ было найдено <2%. Минимальная характерная селективность разделения ближайших пиков ЛФ составила 1,3-1,4. Степень разделения варьировала от 0,3 до 2,5. Точность соответствия стандартам была оценена ?6%.
Условия проведения экспериментов по анализу ЛФ методом малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР).
Смеси (0.1 - 2 мл) для анализа содержали 50 мМ трис-HCl буфер, рН 7,5, 1-6 мг/мл (12-72 мкМ) ЛФ, в некоторые из них добавляли 0.1 - 1 М КСl. К реакционным смесям добавляли АМР, АТР или олигосахарид (0.1-5 мкл) в различных концентрациях, включая насыщающие: 50 мМ нуклеотиды и 5 мМ олигосахарид. В некоторых экспериментах в смесь были добавлены 3 M NaCl или 3 M MgC12 до конечной концентрации 1 М или 5 -25 мМ, соответственно. В МУРР и СР экспериментах использовали те же смеси, что и для гель-хроматографии. Измерения с помощью МУРР и СР и обработку полученных результатов проводили как описано выше.
Измерение индикатрис светорассеяния.
Прибор для измерения светорассеяния от анализируемых образцов (световой дифрактометр) состоял из одного фотодетектора и 14 лазерных монохроматических источников, установленных по внутреннему периметру камеры светорассеяния. В центр камеры помещали образец, а управление установкой и получение значений интенсивности производили при помощи компьютера. При этом поочередно включались лазерные источники и рассеянное излучение попадало в фотоприемник (детектор), после чего сигнал с приемника поступал на фотоэлектронный умножитель, откуда через аналоговый цифровой преобразователь передавался на компьютер. Индикатрисы светорассеяния измеряли в угловом диапазоне 2? = 56,25ч 123,750 (h = 0.0018 ч 0.004 А-1), где h = 4 • ? • n ? sin(?)/?; n - показатель преломления буферной смеси (~1,35). Длина волны используемого светового излучения ? = 4300 А, применима к исследованию частиц 0,005 - 50 мкм, температура образцов при измерении индикатрис 200С. В индикатрисы вносили поправки на фоновое рассеяние и поглощение излучения образцом. Измерения проводились с точностью 3-5%, исходя из оценки точности , где N количество измерений. Чувствительность прибора составляет 10 импульсов/сек.
Калибровку прибора проводили для контроля влияния факторов, влияющих на точность измерений эффектов светорассеяния (состояние чистоты кюветы, аппаратные искажения и помехи). Для этого регулярно измерялись индикатрисы рассеяния (зависимости интенсивности рассеяния от угла) для стандартного образца (полистерин, диаметр частиц 2R = 0,2 мкм). Известно, что радиус инерции (Rg) и радиус (R) для однородной сферы связаны, как .
Для всех полученных в работе экспериментальных данных был проведен математический и статистический анализ. Статистическую обработку результатов проводили методом вариационной статистики с применением t-критерия Стьюдента для средних арифметических (результаты считали достоверными при Р < 0,05).
Условия проведения экспериментов по анализу ЛФ методом абляции.
В экспериментах по абляции использовались те же растворы, что и в описанных выше исследованиях ЛФ методом гель-хроматографии, МУРР и СР. Различные образцы ЛФ (50-100 мкл) наносили в центр квадратов диаметром 1,5-2 см, полученных из силуфольных пластинок. Растворы белка наносили либо на поверхность, покрытую селикагелем, либо на обратную сторону - алюминиевую поверхность. Алюминиевые и силуфольные подложки перед нанесением образцов охлаждали жидким азотом и затем образцы подвергали лиофилизации на стандартной установке. Абляцию вели при интенсивности потока от 5 до 30 Ватт/см2. Анализ результатов абляции проводили, как описано выше.
3.Результаты
Как указано выше, ЛФ образует комплекс с АТР и другими рибо- и дезоксирибонуклеозид-5 - моно - ди и трифосфатами и гидролизует эти нуклеотиды [19, 23, 29]. Кроме того ЛФ взаимодействует с олиго- и полисахаридами и также гидролизует их [22-24, 27-26]. Согласно литературным данным ЛФ в растворе представлен преимущественно двумя формами - мономером и тетрамером [16]. Представлялось интересным исследовать не ведет ли комплексообразование ЛФ с его лигандами к изменению его олигомерного состояния и являются ли мономер и тетрамер действительно основными формами существования ЛФ в растворе или возможно образование промежуточных форм (димера и тримера), а также более высокоолигомерных форм, которые не возможно обнаружить с помощью использованных в литературе методов.
Для изучения олигомерных форм ЛФ необходимы были прямые методы анализа олигомерных форм белков в растворе. Известно, что исп?/p>