Анализ комплексов лактоферрина молока человека
Дипломная работа - Химия
Другие дипломы по предмету Химия
?льзование дифракционных методов для анализа макромолекул и их комплексов позволяет получить информацию о их структуре и дисперсном составе непосредственно в растворе [,].
Для исследования олигомерного состояния ЛФ на первом этапе было использовано два подхода - метод малоуглового рассеяния рентгеновских лучей (МУРР) и светорассеяния (СР). Это определялось тем, что потенциально ЛФ мог находиться в различных олигомерных формах от мономера до высокополимерных состояний. В то же время, с помощью МУРР можно видеть только частицы относительно небольшого размера, характеризуемые параметром h = 0.013 ч 0.103 Е-1, что сопоставимо в размером олигомеров ЛФ, содержащих от 1 до 4 мономерных единиц, этот метод не видит более крупных частиц. Наличие в растворе более крупных частиц с h = 0,00137 ч 0.00206 Е-1 можно анализировать с помощью метода СР.
Обычно в экспериментах по исследованию ЛФ используются препараты белка, которые после очистки хранятся в нейтральных растворах с концентрацией порядка 2 - 10 мг/мл при 4oС или растворы белка замораживаются. Сначала нами были получены рентгенограммы МУРР для стандартного раствора лиофилизованного ЛФ (50 мМ Трис - НСl буфер, рН 7,5), хранившегося в течение месяца при 4оС (рис. 7).
Рис. 7. Рентгенограммы МУРР в координатах I(h) от h для одного из препаратов агрегированного ЛФ (68 мкМ) в 50 мМ Tрис-НCl буфере, рН 7.5, до и после инкубации с 1 M NaCl в течение 1 - 42 ч. Этим четырем кривым соответствуют значения Rg, равные: 43.7, 38.6, 32.9 и 27.4 Е, соответственно. Из данных МУРР следует что ЛФ переходит в мономерную форму при 1 М концентрации NaCl
Данные для ЛФ были построены в координатах Гинье и на их основании рассчитано значение Rg. Согласно данным МУРР оно равно 43.7 Е, что значительно выше ожидаемого и свидетельствует в пользу того, что ЛФ находится в растворе не в моно, а в полидисперсном состоянии. Как известно, при добавлении 1 М NаСl олигомерные формы ЛФ должны диссоциировать до мономеров [16-17]. На рис. 7 приведены данные по изменению рентгенограмм МУРР во времени для раствора ЛФ после добавления NaCl до конечной концентрации 1 М. Из этих данных были оценены величины Rg для ЛФ через разные промежутки времени после добавления NаСl: 38.6 Е (через 1 ч); 32.9 Е (20 ч) и 27.4 Е, (42 ч). Как видно из рис. 7, кривая, соответствующие 42 ч инкубации совпадают с таковыми для ожидаемого мономера ЛФ с величиной Rg = 26.7 Е. Следовательно, диссоциация олигомерных форм ЛФ под действием соли происходит медленно, и только после 42 ч инкубации раствор содержит преимущественно мономерные формы белка.
Эти же растворы были проанализированы с помощью СР (подробнее смотри ниже). По данным СР растворы лиофилизованных препаратов ЛФ содержали олигомеры более высокой олигомеризации, чем тетрамеры, которые можно видеть с помощью МУРР.
Из данных полученных выше, было очевидным, что при длительном хранении растворов ЛФ происходит образование различных олигомерных форм белка. Для исследования эффектов различных лигандов на процессы олигомеризации необходимо было оценить временные интервалы, за которые происходит образование олигомеров в отсутствие и в присутствии различных лигандов ЛФ, а также КСl.
Как известно, ЛФ является исключительно конформационно активным белком [24]. Полученные данные свидетельствовали в пользу того, что в процессе лиофилизации молекулы белка могут переходить в какую-то конформацию, которая не способствует его олигомеризации с образованием форм с исключительно большой мол. массой. По-видимому, в процессе хранения растворов происходит медленное изменение конформации ЛФ и накопление таких мономеров, которые легко образуют его высокоолигомерные формы.
При помощи измерения светорассеяния на угол 900 была исследована кинетика олигомеризации ЛФ после добавления буфера, соли и лигандов (см. рис. 8).
Рис. 8. Относительное изменение светорассеяния на угол 90о при инкубации ЛФ в 50 мМ трис-НСl буфере от отсутствии (а) и в присутствии 0.1 М KCl (б). Реакционные смеси инкубировали в отсутствие других лигандов (кривые 1), в присутствии 50 мМ АТР (кривые 2) или 5 мМ олигосахарида (кривые 3)
Как видно из рис. 8а, в отсутствие КСl, происходит сильное увеличение СР раствора ЛФ в течение первых примерно 10 ч инкубации, а затем ее заметное уменьшение. При добавлении в инкубационную смесь АТР или олигосахарида процесс олигомеризации ЛФ замедляется; максимальные изменения СР наблюдаются после примерно 4-5 ч инкубации, а затем идет медленное возрастание СР.
Добавление 0,1 М КСl скорость начального процесса олигомеризации уменьшается, но после длительной инкубации достигается кажущегося плато значений СР, близкое к таковому для смеси без соли. Добавление АТР или олигосахарида в инкубационную смесь, содержащую 0,1 М КСl, приводит в большей степени к замедлению олигомеризации ЛФ в присутствии олигосахарида, чем АТР. Интересно, что как в отсутствие, так и в присутствии КСl после 100 ч инкубации раствора ЛФ с АТР значение СР выше, чем для растворов без АТ. Наклон кинетических кривых изменения интенсивности СР в присутствии АТР и олигосахарида свидетельствует в пользу того, инкубация смесей более 100 ч (~ 4 дней) может приводить к образованию большего количества олигомерных форм ЛФ в присутствии лигандов, чем в их отсутствии. Учитывая это, в описанных ниже экспериментах анализ содержания олигомерных форм ЛФ проводили после инкубации всех реакционных смесей более 10 дней.
3.1Анализ олигомерных форм ЛФ методом гель-хроматографии
Как отмечалось выше, ЛФ