Анализ комплексов лактоферрина молока человека
Дипломная работа - Химия
Другие дипломы по предмету Химия
том она сохраняет свою каталитическую активность.
В данной работе впервые были сделаны попытки проанализировать на примере комплексов ЛФ возможность анализа олигомерного состояния белков с помощью метода абляции. Сначала были проведены эксперименты по абляции некоторых стандартных белков из лиофилизованного состояния. В качестве подложки для лиофилизации использовали силуфольные пластины. Растворы белков наносили на поверхность пластин, содержащих слой силикагеля и на обратную - чистую сторону алюминиевой пластины. Образцы, нанесенные на пластины, замораживали над жидким азотом и затем подвергали абляции. Было показано, что абляция белков с поверхности, содержащей силикагель, приводит к появлению в спектре в основном частиц с мол. массой, соответствующей использованным белкам. В то же время использованные белки в этом случае подвергались частичной деструкции. В то же время при абляции белков с алюминиевой поверхности заметной деструкции белков не наблюдалось. Аналогичные данные были получены при абляции комплексов ЛФ с силуфольной и алюминиевой поверхности. На рис. 16 приведен спектр белковых частиц, соответствующий комплексу ЛФ после его инкубации в нейтральном буфере в отсутствии соли.
Основной формой ЛФ в случае силуфола (рис. 16а) является тетрамер; димер и мономер не разделились. Наличие частиц в спектре частиц с размером менее 5 нм позволяет предположить, что произошло разрушение не только олигомеров крупнее тетрамера, но так же и разрушение мономера.
Рис. 16. Абляция ЛФ инкубированного в буфере. а) ЛФ аблироавнный с силуфола, б) ЛФ аблированный с алюминиевой подложки
При абляции ЛФ с алюминиевой подложки (рис. 16б) и при меньшей интенсивности излучения, мономер и димер не были обнаружены, но удалось зарегистрировать крупные олигомеры с размером порядка 103 нм, что согласуется данными светорассеяния. При условии что еще более крупные олигомеры не развалились, это может означать, что растворы ЛФ могут содержать ассоциаты типа 16-меров (или больше). Таким образом очевидно, что абляция с алюминиевой подложки более перспективна для исследования нековалентных олигомерных комплексов белков. В то же время нельзя исключить, что лиофилизация на алюминиевой подложке может вести к стабилизации высокоолигомерных комплексов ЛФ, что ведет к исчезновению комплексов меньшего размера, обнаруженных при абляции ЛФ с силуфола и методом гель-хроматографии. В то же время, обнаружение частиц с размером меньше 5 нм при абляции с силуфола может свидетельствовать в пользу разрушения высокоолигомерных комплексов ЛФ при их взаимодествии с силуфолом
3.4Обсуждение результатов
В данной работе было проведено исследование олигомерных форм ЛФ с помощью четырех различных методов. Согласно литературным данным, ЛФ существует в виде двух основных олигомерных форм - мономера и тетрамера. С помощью метода гель-хроматографии в данной работе впервые показано, что в нейтральном буфере в отсутствии соли основной формой белка, устойчивой в условиях хроматографии на Sepharose, действительно является тетрамер, который эффективно диссоциирует до димеров и мономеров после добавления КСl (рис. 10). Нами также впервые показано, что что по данным гель-хроматографии природные лиганды ЛФ (олигосахарид, АТР и АМР) в отсутствие соли понижают степень олигомеризации ЛФ, стимулируя образование преимущественно димерной (АТР и АМР) или мономерной (олигосахарид) формы белка (рис. 11-13), одновременно (по данным СР) повышая сренеквадратичную массу (рис. 14) за счет образования крупных ассоциатов - декамера и предположительно 16 мера.
Интересно, что добавление КСl по-разному влияет на лиганд-зависимую олигомеризацию ЛФ. Олигосахарид в присутствии соли стимулирует образование димера (рис. 11), ATP разрушает тетрамерную и димерную форму ЛФ, и единственный повышает долю крупного олигомера (рис. 12), а в присутствии АМР происходит формирование димера и пентамера (рис. 13). Однако, это все касается форм ЛФ, в той или иной степени устойчивых в условиях гель-хроматографии. Следует полагать, что высокоолигомерные формы ЛФ, которые обнаружены в растворах белка с помощью СР, скорее всего, не устойчивы в условиях гель-хроматографии и разрушаются либо при контакте с сорбентом в самом начале хроматографического процесса, либо в процессе гель-хроматографии. В пользу такого разрушения может указывать наличие длинного размазанного хвоста у пика с мол. массой 754 кДа (рис. 13), соответствующего ЛФ, инкубированному с АМР в отсутствие соли. Данные по гель-хроматографии в целом плохо согласуются с данными СР, всегда показывая меньшую олигомеризацию.
Методом СР были обнаружены крупные олигомеры и оценены их радиусы инерции (рис. 14). Согласно этим данным в растворе ЛФ присутствует в гораздо более высокоолигомерном состоянии, чем следует из данных по гель-хроматографии. Согласно данным СP (рис. 15) все лиганды: олигосахарид < АТР < АМР, в отсутствие KCl стимулируют образование олигомерных форм ЛФ. При этом добавление KCl ведет к примерно одинаковому уменьшению степени олигомеризации ЛФ в буфере содержащем и не содержащем олигосахарид. В то же время, АТР-зависимая степень олигомеризации в присутствии 0,1 М КСl даже несколько больше, чем в отсутствии соли и слабо понижается при повышении концентрации соли до 0,15 М (рис. 16). Максимальный уровень олигомеризации, наблюдаемый в присутствии АМР, постепенно понижается после добавления 0,1 М КСl, а затем 0,15 М соли. Однако, он ост?/p>