Анализ комплексов лактоферрина молока человека
Дипломная работа - Химия
Другие дипломы по предмету Химия
?12 - 30 мкг/107 нейтрофилов
ЛФ представляет собой гликопротеид с мол. массой 76 000 - 80 000 дальтон [1-3]. Белок существует в двух формах - железонасыщенной (холо-ЛФ, 80 кДа) и железоненасыщенной (апо-ЛФ, 75-76,4 кДа). По аминокислотному составу и мол. массе он сходен с трансферрином (73,8 - 86 и 75 - 76,6 кДа холо- и апоформы, соответственно). Аминокислотные составы ЛФ и трансферрина имеют 59% и 49% гомологии между двумя соответствующими доменами, входящими в состав этих белков. Вторичные и третичные структуры этих двух белков также сходны между собой. ЛФ отличается от трансферрина антигенной структурой, углеводными компонентами, изоэлектрической точкой, растворимостью в воде и расположением железосвязыващих участков и сайтов гликозилирования этих белков.
ЛФ образован одной полипептидной цепью, которая содержит 703 аминокислотных остатка. На основании данных рентгеноструктурного анализа с разрешением 2.0 Е была предложена модель трехмерной структуры ЛФ, согласно которой полипептидная цепь свернута в два гомологичных домена, называемых N- и C-долями, содержащими 1-338 и 339-703 остатки соответственно, а их концы соединены короткой a-спиралью (рис. 1). Каждая доля белка состоит из двух доменов: N1, N2 и C1, C2. Третичные структуры железонасыщенного и железоненасыщенного ЛФ различны; для апо-ЛФ характерна открытая конформация N-доли и закрытая конформация С-доли, а для Fe-ЛФ характерна закрытая конформация обеих долей (рис. 1) []. Между N- и C-долями наблюдается значительная степень гомологии: они имеют 125 одинаковых аминокислотных остатков, что составляет 37% гомологии [5].
Это привело к возникновению теории о копировании генов, когда 500 миллионов лет назад первоначальная молекула массой 40 кДа удвоилась и сформировала два гомологичных домена с молекулярной массой около 80 кДа [3]. Предполагают также, что ЛФ возник в процессе эволюции позже трансферрина.
Рис. 1. Структура апо-лактоферрина (железоненасыщенная форма) и Fe-ЛФ (железонасыщенная форма). Красным цветом показан сайт связывания полианионов - гепарина, липополисахаридов и хондриотинсульфата
Углеводный компонент молекулы белка состоит из остатков сиаловой кислоты, фукозы, гексозы и N-ацетилглюкозоамина, которые образуют связи с остатками аспарагина 137 и 478 белковой части ЛФ. ЛФ содержит два сайта гликозилирования по одному на N2 и C2 доменах, но степень гликозилирования белка может быть различной. Именно поэтому мол. масса белка варьирует в диапазоне 76-80 кДа. Показано, что первичная структура гликозидных остатков ЛФ плазмы крови идентична углеводному компоненту ЛФ молока, за исключением двух остатков сахаров, связанных с белком N-гликозидной связью. Функция этих углеводных остатков точно не определена, однако их удаление не влияет на такие функции ЛФ, как связывание рецепторов [3]. ЛФ демонстрирует поразительную устойчивость к действию трипсина и трипсин - подобных протеаз, что обеспечивает сохранение целостности молекул белка в желудке. Было показано, что устойчивость ЛФ к деградации протеазами и при низких значениях рН обусловлена высокой степенью гликозилирования белка [3,]. Железонасыщенная форма ЛФ более устойчива к протеолизу, чем апо-форма белка [3]. ЛФ относится к щелочным белкам, значение его изоэлектрической точки составляет 8,7.
Связывание ионов железа.
Каждая молекула белка может обратимо связывать два иона трехвалентного железа или ионы цинка, меди, магния и других металлов [3]. Причем центры связывания в каждой из двух белковых глобул, входящих в молекулу ЛФ, локализованы ближе к междоменной щели. В этих центрах железо координационно связано с двумя остатками тирозина, одним гистидином и одним остатком аспарагиновой кислоты. Показано, что ЛФ участвует не только в транспорте ионов железа, цинка и меди, но и в регуляции их всасывания. Наличие непрочно связанных ионов цинка и меди не влияет на железосвязывающую функцию ЛФ, а фактически даже усиливает ее. ЛФ образует с железом комплекс красноватого цвета. Одновременно с фиксацией ионов металла в железосвязывающем центре белка происходит фиксация аниона, в физиологических условиях это карбонат или бикарбонат ион, который с помощью электростатических взаимодействий связан с остатком аргинина. Присутствие аниона необходимо для прочного связывания железа с ЛФ, так как он нейтрализует положительный заряд катиона металла [3].
Сродство ЛФ к железу (Кd ~ 10-24 M) в ~300 раз выше, чем сродство трансферрина. Кроме того, показано, что в слабокислой среде сродство ЛФ к железу повышается, что и облегчает переход металла с трансферрина на ЛФ при воспалительных процессах, когда рН тканей снижается за счет накопления молочной и других кислот. Степень насыщения железом нативного ЛФ в женском молоке составляет по оценкам разных авторов от 10 до 30% [13, 14].
Олигомерные формы лактоферрина.
Как в плазме крови, так и в секреторных жидкостях ЛФ может существовать в виде различных олимерных форм от мономера, до тетрамера. Показано [14], что белок обнаруживает резко выраженную тенденцию к полимеризации in vitro и in vivo, и при высоких концентрациях преобладают олигомерные формы ЛФ. Кроме того, с помощью метода гель-хроматографии рядом авторов было обнаружено, что доминирующей формой ЛФ в физиологических условиях является тетрамер; соотношение мономер: тетрамер при концентрации белка 10-5 М составляет 1: 4. Авторы работ [15, 16] также предположили, что олигомерное состояние ЛФ определяется концентрацией данного белка в среде. Кроме того, по их мнению, полимеризация ЛФ строго завис