Физиологическая роль миелопероксидазы в норме и при патологии
Курсовой проект - Медицина, физкультура, здравоохранение
Другие курсовые по предмету Медицина, физкультура, здравоохранение
мбран. Образование окрашенного продукта пероксидазной реакции, выраженное в единицах оптической плотности, происходит в результате способности MPO окислять ортофенилендиамин в присутствии перекиси водорода.
Как видно из представленных результатов (рисунок 3.1) в тестах данной
Рисунок 3.1 - Активность миелопероксидазы нейтрофилов периферической крови в твердофазном спонтанном тесте
Конструкции при использовании выбранных концентраций клеток наблюдается изменение спонтанной ферментативной активности миелопероксидазы иммобилизованных клеток для проб, содержащих 100, 200, 300 и 400 тысяч кл/мл линейного характера. Количество единиц оптической плотности, на которые происходит увеличение активности фермента в каждой экспериментальной точке, отражает среднее значение ферментативной активности Нф для всех доноров в исследуемой выборке.
Таким образом, можно предположить, что данная тест-система носит линейную зависимость между количеством иммобилизованных клеток и миелопероксидазной активностью Нф. Общее количество окрашенного продукта пероксидазной реакции, выраженное в единицах оптической плотности, зависит от концентрации секретируемой из азурофильных гранул MPO.
Такая зависимость, выраженная в единицах оптической плотности, отражает хорошую чувствительность и воспроизводимость результатов и позволяет использовать для анализа количество клеток, равное 200-300х103/мл.
Достоинством твердофазной тест-системы является малое время для выполнения лабораторного теста и его небольшая трудоемкость, также количественный спектрофотометрический учет результатов.
К недостаткам данной лабораторной системы можно отнести стадию иммобилизации клеток на полистироле. Это с одной стороны, уменьшает эффективную концентрацию клеток на стадии активного взаимодействия MPO с субстратом, с другой стороны, способствует появлению большей вариабельности получаемых значений для одной экспериментальной точки, так как адгезивные свойства полиморфноядерных гранулоцитов у разных доноров могут варьировать в значительных пределах.
.2 Определение активности миелопероксидазы в клеточном лизате полиморфноядерных гранулоцитов
Для определения общего содержания и общей активности MPO, содержащейся в гранулах полиморфноядерных гранулоцитов, используется тест оценки пероксидазной активности лизированных клеток со спектрофотометрической оценкой результатов.
Для этого суспензию выделенных из периферической крови Нф в концентрации 100, 200, 300, 400х103 кл/мл помещают в пробирки для микроанализа, вносят равный объем дистиллированной воды, затем добавляют субстратную хромогенную смесь. Перед спектрофотометрией результатов все пробы центрифугируют для удаления из раствора остатков разрушенных или нелизированных клеток.
Либерация МPO в среду инкубации происходит в результате нарушения целостности мембран Нф, сопровождаемое разрушением клеток.
Рисунок 3.2 - Активность миелопероксидазы в клеточном лизате нейтрофилов периферической крови
Полученные экспериментальные данные (рисунок 3.2) отражают практически линейный характер зависимости. Это увеличивает степень чувствительности данной тест-системы, которая допускает использовать в качестве лабораторного метода оценки спонтанной активности MPO концентрацию клеток, равную 200х103/мл, что бывает существенно при дефиците экспериментального материала. При этом следует отметить незначительный разброс экспериментальных данных для одной концентрации клеток, что позволяет предположить достаточно хорошую воспроизводимость результатов.
Положительными характеристиками данного метода оценки миелопероксидазной активности Нф является достаточно высокая чувствительность и воспроизводимость теста.
К недостаткам следует отнести наличие стадии центрифугирования, что увеличивает время проведения лабораторного теста, а также невозможность оценить индуцированную активность MPO полиморфноядерных гранулоцитов и определить коэффициент стимуляции клеток, который может быть использован как критерий оценки физиологического статуса нейтрофильного звена иммунитета.
.3 Определение спонтанной активности миелопероксидазы нейтрофилов в растворе (модифицированный метод) со спектрофотометрическим учетом результатов
Для определения спонтанной активности MPO, секретируемой из азурофильных гранул в среду инкубации, была использована модифицированная нами лабораторная тест-система со спектрофотометрическим учетом результатов.
Для этой цели в полистирольные пробирки для микроанализа, содержащие свежевыделенную суспензию Нф, в концентрации 100, 200, 300, 400х103 кл/мл добавляли по 200 мкл субстратной смеси. Пробы инкубировали при +37оС в течение 15 мин, реакцию останавливали добавлением 10% серной кислоты.
Рисунок 3.3 - Спонтанная активность миелопроксидазы интактных нейтрофилов в растворе (модифицированный метод)
Как видно из представленных результатов (рисунок 3.3), зависимость между концентрацией клеток в экспериментальных пробах и ферментативной активностью MPO, высвобождаемой из азурофильных гранул, носит практически линейный характер и разброс межу отдельными значениями в каждой экспериментальной точке незначителен. Это позволяет предположить, что чувствительность данной лабораторной тест-системы достаточно высока и позволяет использовать ее в качестве лабораторного метода определ?/p>