Физиологическая роль миелопероксидазы в норме и при патологии
Курсовой проект - Медицина, физкультура, здравоохранение
Другие курсовые по предмету Медицина, физкультура, здравоохранение
гипогалоидные кислоты, осуществляют антимикробное действие, но обладая высокой реакционной способностью, они могут повреждать собственные ткани в очагах воспалении.
Рисунок 1.2.6 - Роль МPO в развитии сердечно-сосудистой патологии
MPO трансформирует липопротеины низкой плотности в атерогенную форму, что способствует развитию ранних атеросклеротических поражений сосудов. За счет потребления эндогенного NO в качестве субстрата, МРО может участвовать в развитии дисфункции эндотелия, являющейся одним из ранних изменений атерогенеза и характеризующейся развитием ненормальной сосудистой реактивности и экспрессией различных провоспалительных и протромботических факторов (рисунок 1.2.7). Так было показано, что МРО усиливает катаболизм NO во время ишемии миокарда и реперфузии. Была установлена обратная корреляция между сывороточным уровнем МРО и потоко-опосредованной дилатацией плечевой артерии [44, 53].
Рисунок 1.2.7 - Участие MPO в иммунопатогенезе атеросклеротических поражений сусодов
МPO учавствует также в развитии системных васкулитов. Системный микрососудистый васкулит (МСВ) характеризуется микроваскулярным воспалением и некрозом и чаще всего поражает почки и легкие, вызывая быстро прогрессирующий гломерулонефрит и легочную геморрагию (рисунок 1.2.8). Было показано, что МСВ ассоциирован с наличием аутоантител к цитоплазматическим, лизосомальным компонентам нейтрофилов и моноцитов, в частности к МРО. Такие аутоантитела были названы антинейтрофильными цитоплазматическими аутоантителами (ANCA). Аутоантитела к МРО были обнаружены у больных с микроскопическим полиангиитом, аутоиммуным некротизирующим серповидным гломерулонефритом и синдромом Churg-Strauss. При этом изменения титра аутоантител отражали интенсивность заболевания [15, 42].
Рисунок 1.2.8 - Иммунопатогенез МСВ
В опытах in vitro было показано, что ANCA могут активировать TНФa-примированные Нф, вызывая дегрануляцию, продукцию реактивных окислительных метаболитов, секрецию провоспалительных цитокинов. Кроме того, ANCA усиливали адгезию Нф к эндотелиальному монослою. Совместная инкубация ANCA-активированных Нф и эндотелиальных клеток приводила к лизису эндотелиоцитов [42].
С другой стороны, у пациентов с дефицитом MPO, как правило снижается сопротивляемость организма и повышается чувствительность к инфекциям. Т. к., генерируемые MPO окислители (HOCI, HOBr, свободные радикалы и др.), являются высокореакционными соединениями; именно им пренадлежит основная микробицидная функция Нф [47].
.3 Методы оценки ферментативной активности нейтрофилов
Оценка ферментативной активности Нф используется при оценке иммунного статуса организма. Ферментативную активность клеток определяют для ферментов: миелопероксидазы, аденозинтрифосфатазы, кислой фосфатазы, нитро-синего тетразолия, цитохромоксидазы, лактатдегидрогеназы, сукцинатдегидрогеназы и катионных белков [27].
) НСТ-тест. Принцип НСТ-теста состоит в образовании нерастворимых окрашенных гранул формазана при восстановлении нитросинего тетразолия (НСТ) супероксидным анион-радикалом, образующимся при активации Фк. Этот тест отражает степень активизации кислородозависимых механизмов бактерицидной активности Фк, в основе которых лежит активация НАДФ-Н2-оксидазы и гексозомонофосфатного шунта. Электроны, освобожденные с НАДФ-Н2, превращают молекулярный кислород в супер-оксиданион, восстанавливающий нитросиний тетразолий. Различают спонтанный НСТ-тест с интактными полиморфноядерными лейкоцитами, не подвергавшимися воздействию стимуляторов, и индуцированный [16, 39].
Выделенная клеточная взвесь с концентрацией 2106 кл/мл на основе среды 199, включающей НСТ (nitro blue tetrazolium 0,5 мг/мл), делится на две части и в половину из проб вносится S.aureus в концентрации 2107 кл/мл. Затем взвесь клеток с бактериями и без них разносится по 100 мкл в лунки плоскодонного 96-луночного планшета по три на каждый образец. После инкубации при 37С в течение 45 мин клеточный монослой трижды отмывается теплым раствором Хенкса без фенолового красного от раствора НСТ и непоглощенных бактерий и высушивается. Монослой клеток фиксируется в парах формалина в течение 15 мин. Затем клетки разрушают путем добавления в лунки предварительно разогретого до 83С диметилсульфамида (DMSO, производство ICN) по 50 мкл. Оптическая плотность полученных растворов измеряется на спектрофотометре "Multiscan Titertek Plus" ("Flow lab.") при длине волны 540 нм [46].
) Тесты на фиксированных образцах
Определение активности ферментов проводится на фиксированных образцах, которые приготовляются следующим образом. Выделенная клеточная взвесь с концентрацией 2106 кл/мл делится на две части и в половину из проб вносится S.aureus в концентрации 2107 кл/мл. Затем взвесь клеток с бактериями и без них разносится по 100 мкл в лунки плоскодонного 96-луночного планшета по три на каждый образец. После инкубации при 37С в течение 45 мин клеточный монослой трижды отмывается теплым раствором Хенкса без фенолового красного от непоглощенных бактерий и высушивается. Затем фиксируют в парах формалина в течение 15 мин, после чего исследуют ферментативную активность клеток [49].
) Определение активности миелопероксидазы
А) Твердофазный метод
Свежеприготовленный субстратный раствор (к 10 мл фосфатно-цитратного буфера (рН 5,0) добавляется 4 мг o-phenylenediamine (ICN) и 500 мкл 0,33% перекиси водорода) по 100 мкл вносится в лунки планшета, содерж?/p>