Физиологическая роль миелопероксидазы в норме и при патологии
Курсовой проект - Медицина, физкультура, здравоохранение
Другие курсовые по предмету Медицина, физкультура, здравоохранение
°щие адгезированные на пластик и фиксированные клетки. Планшет инкубируется при комнатной температуре в течение 10 мин, затем реакция останавливается добавлением 10% раствора серной кислоты по 100 мкл на лунку. Оптическая плотность раствора определяется на спектрофотометре "Multiscan Titertek Plus" ("Flow lab.") при длине волны 492 нм) [38].
Б) Цитохимические методы
Пероксидаза является ферментом - лизосомальной каталазой, катализирующей в присутствии перекиси водорода окисление различных субстратов. При окислении ортотолидина или бензидина, используемых в реакциях, образуются интенсивно окрашенные соединения, в том случае, если в клетке присутствует пероксидаза, при взаимодействии с которой перекись водорода разрушается с выделением кислорода, который и окисляет орто-толидин или бензидин, переводя их в окрашенные соединения (рисунок 1.3). В цитохимических реакциях активность фермента определяется по окислению хромогенов (бензидина, о-дианизидина и других) по методу Грэхема-Кнолля или его модификаций [2, 45].
Рисунок 1.3 - Реакция на миелопероксидазу
Метод Грэхема-Кнолля. В присутствии миелопероксидазы бензидин окисляется перекисью водорода в коричневый оксибензидин.
Свежие мазки фиксируют 4% формалиново-спиртовым раствором в течение 30 секунд.
Обмывают в проточной воде и высушивают.
Заливают пероксидазным реактивом на 5 минут.
Тщательно промывают в проточной воде и высушивают.
Докрашивают красителем Романовского-Гимзы.
Миелопероксидаза выявляется в цитоплазме клеток в виде коричневых гранул [20].
В) Спектрофотометрический метод определение активности миелопероксидазы в клеточном лизате Нф
Содержание MPO в лизате Нф оценивают количественным спектрофотометрическим методом с использованием 0,04% раствора ортофенилендиамина (ОФД) на фосфатном буфере с pH 5,0 и добавлением 0,33% раствора перекиси водорода в соотношении 20:1 по объему. Длина волны 495 нм [36].
Нф помещают дистилированную воду; получают клеточный лизат.
Производят титрование лизата
Добавляют пероксидазный субстрат
Измеряют оптическую плотность [44].
) Определение активности кислой фосфатазы
В лунки плоскодонного 96-луночного планшета, содержавшего фиксированные клетки, вносится по 50 мкл раствора паранитрофенилфосфата (ПНФФ-раствор, ICN). Для его приготовления 0,09 г ПНФФ и 0,31 г NaCl растворялось в 37 мл 1М натрий-цитратного буфера (рН 5,5). Образцы инкубируются при 37С в течение 30 мин. Затем добавлением 0,2 М раствора NaOH по 100 мкл на лунку реакция останавливается. Оптическая плотность раствора измеряется на спектрофотометре "Multiscan Titertek Plus" ("Flow lab.") при длине волны 405 нм. [51].
) Определение активности цитохромоксидазы
Свежеприготовленный субстратный раствор (к 10 мл 0,1 М ацетатного буфера, рН 5,5, добавляем 20 мг 3,3*-diaminobenzidine (ICN), 100 мг MnCl2 и 300 мкл 0,33% перекиси водорода) по 100 мкл вносится в лунки планшета, содержащие фиксированные клетки. Планшет инкубируется при комнатной температуре в течение 10 мин, затем реакция останавливается добавлением 10% раствора серной кислоты по 100 мкл на лунку. Оптическая плотность определяется на спектрофотометре "Multiscan Titertek Plus" ("Flow lab.") при длине волны 492 нм [39].
) Определение активности лактатдегидрогеназы
К адгезированным и фиксированным на пластике клеткам добавляется 100 мкл раствора iodonitrotetrazolium violet (йоднитротетразолий, ЙНТ, производства ICN) с концентрацией 2 мг/мл. Для этого 20 мг ЙНТ растворяется сначала в 0,5 мл 70 спирта, а затем добавляется 9,5 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,2-7,4), включающего 4 мл 1% раствора MnCl2. Монослой клеток вместе с раствором ЙНТ инкубируется при 37С в течение 30 мин, после чего надосадок удаляется, монослой клеток дважды отмывается раствором Хенкса и высушивается. Расположенные внутриклеточно гранулы диформазана растворяют 100 мкл изопропилового спирта, подкисленного 0,04 М HCl, в течение 20 мин. Оптическая плотность раствора определяется на микроплатном рейдере при длине волны 492 нм .
) Определение активности сукцинатдегидрогеназы
Определение активности фермента проводится в МТТ-тесте, где в качестве субстрата используется 3-(4,5-dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (метилтиазолилтетразолий бромид, МТТ, производства ICN). В лунки к фиксированным клеткам добавляется по 100 мкл МТТ (2 мг/мл) на основе 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,2-7,4), включающего 4 мл 1% раствора MnCl2. Монослой клеток вместе с раствором МТТ инкубируется при 37С в течение 30 мин, после чего надосадок удаляется, монослой клеток дважды отмывается раствором Хенкса и высушивается на воздухе. Для подсчета гранул бромида диформазана клетки разрушаются добавлением 100 мкл изопропилового спирта, подкисленного 0,4 М HCl. Оптическая плотность определяется на микроплатном рейдере при длине волны 540 нм. Реакции ставятся в триплетах лунок плоскодонного 96-луночного планшета с не стимулированными и стимулированными клетками. Оптическую плотность раствора измеряют на микропроцессоре Titertek Multiscan Plus ("Flow lab.") при соответствующей для каждого фермента длине волны [16].
2. Материалы и методы исследования
.1 Использованные материалы
В работе были использованы следующие реактивы: хлорид натрия NaCl (Пять океанов, г. Минск, хч), хлорид калия KCl (Пять океанов, г.Минск, хч), гидрофосфат натрия NaH2PO4 (Пять океанов, г.Минск, хч), глюкоза, фиколл-урографин (Sigma, Германия, хч), краситель Романовского-Гимзы (МиниМед, г.Брянск), уксусная кислота (Ла?/p>