Физиологическая роль миелопероксидазы в норме и при патологии
Курсовой проект - Медицина, физкультура, здравоохранение
Другие курсовые по предмету Медицина, физкультура, здравоохранение
?ерна, г. Москва, хч).
В качестве основного буферного раствора использовали 10мМ калий-натрий фосфатный буфер, содержащий 140мМ NaCl, 10мМ KCl, 10мМ NaH2PO4, 5мМ глюкозы; рН 7,3, а также 0,1М натрий-цитратный буфер, рН 4,5.
.2 Получение полиморфноядерных гранулоцитов из периферической крови
В экспериментах была использована кровь пятнадцати здоровых доноров.
Для получения нейтрофилов к цельной венозной крови добавляли равный объем рабочего буфера, затем наслаивали на градиент фиколл-урографина (?=1,085/1,18) в соотношении объемов 2:1, центрифугировали 30 минут при 2000 об/мин, после чего отбирали образовавшийся слой лейкоцитов. К выделенной клеточной суспензии добавляли 10мМ К,Na-фосфатный буфер. Концентрацию лейкоцитов определяли путем подсчета в камере Горяева.
кровь человек гранулярный полиморфноядерный
2.3 Определение активности миелопероксидазы полиморфноядерных гранулоцитов в спонтанном тесте
Непосредственно перед экспериментами готовились разведения клеточной суспензии нейтрофилов в концентрациях: 100, 200, 300 и 400 тысяч клеток в пробе.
В качестве субстрата использовали свежеприготовленную смесь следующего состава: ортофенилендиамин (0,04%), перекись водорода (0,002%) на 0,1М фосфатно-цитратном буфере (pH=4,5).
.3.1 Определение спонтанной активности миелопероксидазы полиморфноядерных гранулоцитов с помощью твердофазного метода
Аликвоты клеточной суспензии 100 мкл (в концентрации 100, 200, 300 и 400 тыс. клеток в пробе) помещали в лунки плоскодонного 96-луночного планшета, инкубировали в течение 60 минут при 37?С, затем клеточную суспензию удаляли и лунки трижды промывали рабочим буфером. Затем в каждую лунку вносили свежеприготовленную субстратную смесь в объеме 200 мкл и инкубировали при 37?С 15 минут. Остановку реакции производили добавлением 10% серной кислоты. Результаты оценивали спектрофотометрически при длине волны 492 нм.
.3.2 Определение активности миелопероксидазы в клеточном лизате полиморфноядерных гранулоцитов
В пробирки для микроанализа вносили 200 мкл суспензии нейтрофилов (в концентрации 100, 200, 300 и 400 тыс. клеток в пробе), добавляли равный объем дистиллированной воды и инкубировали при 37?С в течении 1 часа. Затем в каждую пробирку вносили свежеприготовленную субстратную смесь и инкубировали при 37?С 15 минут. Остановку реакции производили добавлением 10% серной кислоты, затем центрифугировали 15 мин. при 2000 об/мин.
Результаты оценивали спектрофотометрически при длине волны 492 нм.
.3.3 Определение активности миелопероксидазы полиморфноядерных гранулоцитов с помощью спонтанного теста в растворе (модифицированный метод)
При проведении спонтанного теста интактные нейтрофилы вносили в пробирки для микроанализа в объеме 200 мкл (в концентрации 100, 200, 300 и 400 тыс. клеток в пробе), затем добавляли 200 мкл субстратной смеси, состоящей из ортофенилендиамина (0,04%) и 0,002% перекиси водорода в 0.1М фосфатно-цитратном буфере, pH=4,5. Через 15 мин реакцию останавливали добавлением 200 мкл 10% серной кислоты., затем пробы центрифугировали 15 мин. при 2000 об/мин.
Результаты оценивались спектрофотометрически при длине волны 492 нм.
.4 Статистическая обработка результатов
Статистическая обработка полученных экспериментальных данных проводилась с использованием пакета программ Statistica 6.0. Оценка достоверности полученных результатов, не подчиняющихся закону нормального распределения, проводилась с использованием непараметрических методов: критерия по Краскелу-Уоллису, Манна-Уитни, Колмогорова-Смирнова, Вальда-Вольфовица. Различия считали достоверными при уровне статистической значимости p<0,05. Полученные данные представлены в виде медианы и 25-75 квартилей.
2.5 Оценка модифицированной лабораторной тест-системы посредством ее сравнения с общепринятым методом определения ферментативной активности полиморфноядерных гранулоцитов на основе Референтного теста, в качестве которого был принят метод определения активности миелопероксидазы с помощью твердофазного метода
Референтный метод - классический эксперимент или вид клинических исследований, позволяющий свести к минимуму систематичекие ошибки.
3. Результаты и обсуждение
.1 Определение активности миелопероксидазы полиморфноядерных гранулоцитов в тесте с использованием клеток, иммобилизованных на гидрофобной поверхности
Для определения спонтанной секреции MPO азурофильных гранул полиморфноядерных гранулоцитов была использована тест-система, достаточно широко используемая в лабораторной практике, включающая Нф, предварительно иммобилизованные на поверхности полистирольного планшета с концентрацией клеток в экспериментальной пробе, равной 100, 200, 300, 400х103 кл/мл, с последующим внесением субстратной смеси, состоящей из перекиси водорода и ортофенилендиамина в рабочем буфере. Результаты оценивались спектрофотометрически при длине волны 492 нм.
Высвобождение депонированного фермента в среду инкубации происходит благодаря феномену слияния мембран азурофильных гранул и плазматической мембраны Нф. Основной эндогенный фактор слияния - ионы Са2+, резко снижающие гидратационный барьер при интеграции мембран. Ионы Са2+ нейтрализуют отрицательный поверхностный заряд, непосредственно модифицируя структуру липидного бислоя и дестабилизируют ее, создавая кальциевые мостики между двумя контактирующими мембранами, и тем самым индуцируя соединение ме