Мусієнко М. М., Панюта О. О. Біотехнологія рослин. Навчальний посібник
| Вид материала | Документы |
- Ослин навчальний посібник до лабораторних занять з фізіології рослин для студентів, 2678.12kb.
- Удк 581. 8 (075. 8) Брайон О. В., Панюта О. О., Паршикова Т. В., Славний, 518.84kb.
- Практикум з педагогіки вищої школи: Навчальний посібник за модульно-рейтинговою системою, 411.72kb.
- Дмитриченко М. Ф., Навчальний посібник, 2529.95kb.
- Дмитриченко М. Ф., Навчальний посібник, 2842.03kb.
- Наталя Чабан навчальний посібник з історії української культури мвс україни, 9171.9kb.
- Програма вступних фахових випробувань за спеціальністю «фізіологія рослин» освітньо-кваліфікаційний, 164.35kb.
- Рекомендовано Міністерством освіти України як навчальний посібник для студентів архітектурних, 1979.84kb.
- Т. Г. Сабірзянов Печі ливарних цехів. Гриф «Навчальний посібник», 375.04kb.
- Н. М. Борівська Навчальний посібник містить цікавий матеріал стосовно урок, 283.61kb.
Таблиця 8
Середовища для культивування in vitro рослин і калюсної тканини
| Компоненти | Середовище для рослин - МС | Калюсне середовище №1* | Калюсне середовище №2** |
| NH4NO3 | 1650 | 1650 | 1650 |
| KNO3 | 1900 | 1900 | 1900 |
| CaCl22H2O | 440 | 440 | 440 |
| MgSO47H2O | 370 | 370 | 370 |
| KH2PO4 | 170 | 170 | 170 |
| FeSO4·7H2O | 27,8 | 27,8 | 27,8 |
| Na2EDTA·2H2O | 37,3 | 37,3 | 37,3 |
| H3BO3 | 6 | 6 | 6 |
| ZnSO47H2O | 8,6 | 8,6 | 8,6 |
| CuSO45H2O | 0,025 | 0,025 | 0,025 |
| CoCl26H2O | 0,025 | 0,025 | 0,025 |
| KI | 0,83 | 0,83 | 0,83 |
| Na2MoO42H2O | 0,25 | 0,25 | 0,25 |
| MnSO44H2O | 22,3 | 22,3 | 22,3 |
| Мезоінозит | 100 | 100 | 100 |
| PP | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
| B1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 |
| B6 | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
| НОК | | | 2 |
| 2,4-Д | | 3 | 2 |
| Кінетин | | 1 | 1 |
| Сахароза | 30000 | 25000 | 25000 |
| Агар | 0,7% | 0,7% | 0,7% |
| рН | 5,6 – 5,8 | ||
* - середовище для калюсу картоплі
** - середовище для калюсу гвоздики, тютюну, топінамбура, сої, моркви
Живильні середовища готують на бідистильованій або дистильованій воді.
Середовища за консистенцією бувають тверді, або агарові, і рідкі залежно від цілей досліджень.
^ Робота 1. Приготування маточних розчинів для
середовища Мурасиге і Скуга (МС)
Мета роботи: Приготувати маточні розчини макро- і мікросолей, вітамінів, фітогормонів, Fe-хелату.
^ Матеріали і обладнання: NH4NO3 , KNO3 , CaCl2, Mg SO4·7H2O, KH2PO4, H3BO3, MnSO4·4H2O, ZnSO4·4H2O, KI, Na2MoO4·2H2O, CuSO4·5H2O, CoCl2·6H2O, FeSO4·7H2O, Na2EDTA·2H2O, спирт, 1N НCl i 1N КOH, ваги, магнітний змішувач, плитка, лопатки (шпателі), лабораторний посуд - стакан або колба об’ємом 1 л, мірні циліндри 500 мл, 100 мл, мірні піпетки - 5 мл, 1 мл, пляшки з темного скла - 1 л, 100 мл, 50 мл, 25 мл.
Для розчинів макросолей і вітамінів бажано стерильний посуд.
^ ХІД РОБОТИ
- Приготувати розчини макро- і мікросолей.
Маточні розчини макросолей готують у концентраціях, що у 10 разів перевищують потрібні, а маточні розчини мікроелементів – у концентраціях у 100 разів більших.
Макро МС - 1 л розчину солей; по 100 мл розчину солей на 1 л середовища.
NH4NO3 16,5 г
KNO3 19,0 г
CaCl2 3,3 г
Mg SO4·7Н2О 4,2 г
KH2PO4 1,7 г
Мікро МС - 100 мл розчину солей; по 1 мл розчину солей на 1 л середовища.
H3BO3 620 мг
MnSO4·4H2O 2,23 г
ZnSO4·4H2O 860 мг
KI 83 мг розчиняти окремо
Na2MoO4·2H2O 25 мг розчиняти окремо
CuSO4·5H2O 2,5 мг
CoCl2·6H2O 2,5 мг
2. Приготувати розчин Fe-хелат.
100 мл розчину; по 5 мл на 1 л середовища.
FeSO4·7H2O 557 мг
Na2EDTA·2H2O 745 мг
Наважки розчинити окремо у бідистиляті, злити і довести до кипіння.
3. Приготувати розчини фітогормонів: 2,4-Д і кінетин.
Розчини фітогормонів готують таким чином: цитокініни (кінетин, зеатин, БАП) спочатку розчиняють у невеликій кількості 1N розчину лугу або кислоти, ауксини (ІОК, НОК, 2,4-Д) - у краплі етанолу, підігрівають і додають відповідний об’єм бідистильованої води; гібереліни розчиняють у бідистильованій воді.
Концентрація 1 мг/мл.
- Приготувати розчини вітамінів В1, В6 і РР.
^ Розчиняти у бідистильованій воді.
Концентрація 1 мг/мл.
Робота 2. Приготування середовища Мурасиге і Скуга (МС).
Стерилізація середовища автоклавуванням
Мета роботи: приготувати живильне середовище Мурасиге і Скуга (МС) і простерилізувати середовище автоклавуванням.
^ Матеріали і обладнання: маточні розчини макро- і мікро солей, Fe-хелату і вітамінів, мезо-інозит, сахароза, агар, 1 N HCl і 1N КОН, ваги, шпателі, магнітний змішувач, рН-метр, плитка, автоклав, стакан або колба об’ємом 1 л, мірні циліндри - 500 мл, 100 мл, мірні піпетки - 5 мл, 1 мл, ватні пробки або фольга.
^ ХІД РОБОТИ
Для приготування 1 л середовища Мурасиге і Скуга (МС) необхідно взяти:
Макро МС 100 мл
Мікро МС 1 мл
Fe-хелат 5 мл
В1 1 мг
В6 1 мг
РР 0,5 мг
мезо-інозит 100 мг
сахароза 30 г (3%)
агар 7 г
1. Для приготування 1 л середовища МС колбу або стакан (1 л) помістити на магнітний змішувач, налити 250-300 мл бідистиляту і додати точно відмірену кількість розчинів макро- і мікросолей, Fe-хелат, вітамінів і фітогормонів, якщо останні входять до складу середовища.
2. Зважити потрібну кількість мезо-інозиту, сахарози і органічних добавок, якщо вони входять до складу середовища. Кожну наважку розчинити у окремій порції бідистильованої води.
3. Довести рН до 5,6-5,8 за допомогою 1N КОН або 1N НСl.
4. Наважку агару помістити у термостійку колбу або стакан, залити холодною бідистильованою водою (300-400 мл), залишити на 20 хв. для набухання і нагріти, постійно помішуючи до повного розчинення агару.
При приготуванні рідкого середовища агар не додається.
5. Додати розчинений агар до розчину 1 і довести до потрібного об’єму бідистильованою водою. Розчин і воду підігріти.
6. Розлити тепле середовище у колби або пробірки і закрити ватними пробками або фольгою.
^ У колби наливаємо середовище до 1/2-2/3 об’єму.
7. Простерилізувати середовище в автоклаві при тиску 0,8-1 атм (температура 115-1200С ) 20-25 хв залежно від об’єму (табл. 2).
Після закінчення стерилізації середовища в автоклаві варто повільно зменшувати тиск в апараті і відкривати кришку тільки після того, як внутрішній тиск буде дорівнювати зовнішньому ( на манометрі стрілка буде на 0). Інакше, через різку зміну тиску може статися змочування середовищем пробок і навіть їх виштовхування.
^ Робота 3. Стерилізація рідких середовищ пропусканням
через бактеріальний фільтр (холодна стерилізація)
Мета роботи: оволодіти навиками стерилізації середовищ через бактеріальні фільтри; навчитися збирати і стерилізувати фільтри.
^ Матеріали і обладнання: маточні розчини макро- і мікросолей, вітамінів, Fe-хелату, ваги, шпателі, сахароза, мезоінозит, рН-метр, фільтр Зейтца, колба Бунзена, автоклав, ламінар-бокс, насос Камовського, стерильні колби, закриті фольгою, пробірки, мірні піпетки.
^ ХІД РОБОТИ
1. Зібрати фільтр Зейтца.
1.1. Розгвинтити металевий корпус фільтра.
1.2. В нижню частину корпуса закласти металеву сітку, потім однакового діаметру з корпусом кільце з тонкої гуми, диск із фільтрувального паперу, ультрафільтр, другий диск фільтрувального паперу і гумове кільце.
Мембранний ультрафільтр має блискучу і матову поверхні, при зборці його слід класти матовою поверхнею в сторону сітки.
1.3. Накласти верхню частину корпуса і пригвинтити її до нижньої, але не повністю.
2. Зібраний фільтр Зейтца за допомогою гумової пробки вмонтувати в колбу Бунзена. На бічний відросток колби одягнути вакуумний шланг. Для запобігання забрудненню з повітря у шланг вставити з’єднану з насосом скляну трубку з ватним тампоном.
3. Зібраний і з’єднаний з колбою фільтр Зейтца загорнути в цупкий обгортковий папір або целофан.
4. Простерилізувати фільтр в автоклаві при 1 атм і 1200С 30 хв.
5. Після автоклавування гвинти, які з’єднують верхню і нижню частини корпуса, туго загвинтити і для забезпечення більшої герметичності залити місця з’єднання пробки з колбою і фільтром парафіном.
6. Приготувати 100 мл рідкого ( без агару )середовища МС ( робота 2 ).
7. Профільтрувати середовище з використанням вакууму (насос Камовського або водоструминний насос).
^ Фільтрат має повільно скапувати краплинами, якщо ж він стікає швидше, це може свідчити про порушення цілісності фільтра.
Після закінчення фільтрування слід повільно запускати повітря в колбу, інакше ватний тампон засмокчеться всередину і фільтрат буде інфіковано.
8. Послідуючі операції проводити у ламінар-боксі.
Підготувати ламінар-бокс до роботи.
9. Обпалити систему ватним тампоном, змоченим у спирті.
10. У полум’ї спиртівки акуратно від’єднати фільтр Зейтца від колби Бунзена.
11. Обпалити горло колби у полум’ї спиртівки.
12. Перелити фільтрат із колби у стерильну колбу, в якій він буде зберігатися.
13. Обпалити горло колби у полум’ї спиртівки і закрити стерильною фольгою.
Стерилізація рослинного матеріалу
Робота 4. Стерилізація насіння і вирощування
асептичних рослин
Залежно від ступеня забруднення насіння ділять на три групи:
1- із незначним зараженням поверхні мікроорганізмами (насіння пшениці, сорго, капусти);
2 - із зараженням лише зовнішньої поверхні насіння (латук, шпинат, редис, томат, кукурудза, морква);
3 - з наявністю мікроорганізмів на поверхні і в середині насіння (рис, соняшник, соя, сосна).
Знаючи, до якої групи належить насіння, обирають режим обробки насіннєвого матеріалу, проте стерилізуючу речовину, її концентрацію, а також час стерилізації необхідно підбирати для кожного виду і сорту дослідним шляхом.
^ Мета роботи: підібрати концентрацію стерилізуючого розчину та час стерилізації насіння, що забезпечать найвищу ефективність цього процесу. Отримати стерильне насіння і виростити з нього асептичні рослини.
^ Матеріали і обладнання: мильний розчин, 70%-й розчин спирту, стаканчики із стерильною водою, концентрований розчин “Білизни”, стаканчики для стерилізуючих розчинів, мірний циліндр, насіння сої, пробірки з безгормональним середовищем МС ( табл. 8) для рослин сої, чашки Петрі зі стерильним фільтрувальним папером, стерильні чашки Петрі, марля, пінцети, скальпелі, спиртівка, спирт для стерилізації інструментів, ламінар-бокс.
^ ХІД РОБОТИ
1. Приготувати розчини “Білизни” різної концентрації:
І – 1 частина препарату і 4 частини води ( 1:4 ),
ІІ – 1 частина препарату і 3 частини води ( 1:3 ),
ІІІ – 1 частина препарату і 2 частини води ( 1:2 ),
ІV – 1 частина препарату і 1 частина води ( 1:1 ).
Розчини використовуються одноразово відразу ж після приготування.
2. Промити насінини сої мильним розчином.
3. У марлеві мішечки покласти по 10 насінин.
4. Промиті насінини у боксі на 1 хв помістити у стаканчик з 70% етанолом.
5. Стерильним пінцетом перенести мішечки з насінинами у стаканчики з відповідною концентрацією стерилізуючого розчину і витримати відповідний час ( табл. 9 ).
^ Об’єм насіння має займати 1/4 об’єму стерилізуючого розчину. Мішечки потрібно перевертати кожні 2 хвилини, щоб розчин гарно змочував насіння.
6. Простерилізоване насіння промити у стерильній дистильованій воді. Стерильним пінцетом перенести мішечки із стакана зі стерилізуючим розчином у стакан із стерильною дистильованою водою. Витримати 10 хв. Промивання повторити 3 рази використовуючи нову порцію води.
7. Мішечки з промитим насінням стерильним пінцетом перенести у стерильну чашку Петрі з проавтоклавованими паперовими фільтрами, щоб забрати надлишок води.
8. Стерильним пінцетом перенести один із мішечків до іншої чашки Петрі, розгорнути його двома пінцетами і згребти насіння у чашку Петрі.
9. Стерильним пінцетом перенести насінини на безгормональне живильне середовище у пробірки.
Відкрити пробірку, обпалити горло пробірки у полум’ї спиртівки, стерильним пінцетом помістити насінину на середовище, знову обпалити горло пробірки і пробку у полум’ї спиртівки, після чого закрити пробірку пробкою.
Підписати пробірку, зазначивши середовище, вид або сорт рослини і дату посадки.
10. Пробірки з насінням помістити у термостат при температурі 250 +10 С.
11. Через 4-6 діб перевірити чистоту посіву і схожість насіння.
12. Після проростання насіння пробірки перенести у термостат з освітленням 400 лк і температурою 250+ 10С.
Оформлення роботи. Визначити найефективніші умови стерилізації насінин сої. Визначити відсоток асептичного насіння при різних умовах стерилізації. Результати представити у таблиці 9.
Таблиця 9
| № п/п | Концентрація розчину “Білизни” | Тривалість стерилізації, хв | Загальна кількість насіння | Кількість інфіковано-го насіння через 7 днів | Схожість насіння | Ефективність стерилізації, % | ||
| штук | % | штук | % | |||||
| 1 2 3 | 1:4 | 10 15 30 | | | | | | |
| 4 5 6 | 1:3 | 10 15 30 | | | | | | |
| 7 8 9 | 1:2 | 10 15 30 | | | | | | |
| 10 11 12 | 1:1 | 10 15 30 | | | | | | |
^ Робота 5. Стерилізація бульб, коренеплодів і кореневищ
Для отримання експлантатів використовують здорові бульби, коренеплоди або кореневища.
Мета роботи: оволодіти методикою стерилізації обпалюванням бульб, коренеплодів і кореневищ, отримати первинний калюс.
^ Матеріали і обладнання: бульби картоплі, мильний розчин, чашки Петрі з калюсним середовищем №1 ( табл.8 ), пінцети, скальпелі, пробкові свердла, спирт, спиртівка, ламінар-бокс, парафілм.
^ ХІД РОБОТИ
1. Бульби вимити проточною водою.
2. Обчистити бульби від шкірки.
3. Бульби вимити у мильному розчині, а потім ополоснути дистилятом.
4. У боксі бульбу на кілька секунд занурити у спирт, дати йому стекти і обпалити бульбу у полум’ї спиртівки.
5. Покласти обпалену бульбу у стерильну чашку Петрі.
6. Притримуючи картоплину стерильним пінцетом, скальпелем відрізати частину бульби.
7. Стерильним пробковим свердлом вичленити циліндр з бульби.
8. Циліндр тканини порізати скальпелем на диски, які помістити на середовище для калюсогенезу. Два крайні диски відкинути.
9. Чашки Петрі підписати і закрити парафілмом.
10. Чашки з експлантатами культивувати у термостаті без освітлення при 250+10С.
Як рослинний матеріал в даній роботі можна використати бульби топінамбура, коренеплоди моркви, кореневища женьшеню.
Робота 6. Стерилізація листків
^ Мета роботи: підібрати оптимальні умови стерилізації листків картоплі, отримати стерильну калюсну культуру.
Матеріали і обладнання: рослини картоплі, вирощені в теплиці, мильний розчин, 70%-й розчин спирту, стаканчики зі стерильною дистильованою водою, концентрований розчин “Білизни”, стаканчики для стерилізуючих розчинів, чашки Петрі зі стерильним калюсним середовищем №1 ( табл.8 ), чашки Петрі зі стерильним фільтрувальним папером, стерильні чашки Петрі, пінцети, скальпелі, спиртівка, спирт, ламінар бокс, парафілм.
^ ХІД РОБОТИ
1. Приготувати розбавлені розчини “Білизни”( робота 4 ).
2. Інтактні листки картоплі промити у проточній воді, витримати 1-2 хв. у мильному розчині, промити проточною, а потім дистильованою водою.
3. Промиті листки у боксі занурити у 70%-й етанол на 10-15 сек.
4. Рослинний матеріал помістити у стерилізуючий розчин з відповідною концентрацією “Білизни” і витримати відповідний час ( табл. 10 ).
5. Рослинний матеріал відмити у трьох порціях стерильної дистильованої води (витримати по10 хв.).
6. Для підсушування стерильним пінцетом перенести рослинний матеріал у стерильну чашку Петрі з фільтрувальним папером.
7. Стерильний листок розчленити на експлантати по 5-10 мм, які помістити на живильне середовище.
8. Чашку підписати і закрити парафілмом.
9. Чашки з рослинним матеріалом культивувати у термостаті без освітлення при 250+10С.
10. Через 4-7днів визначити оптимальні умови стерилізації. Життєздатність культури оцінити через 25-30 днів: по периметру життєздатного експлантата утвориться калюс.
Результати досліджень представити у таблиці 10.
Таблиця 10
| № п/п | Концентра-ція розчину “Білизни” | Тривалість стерилізації (хв) | Загальна кількість експлан-татів | Кількість асептичних експлантатів через7 днів | Кількість життєздатних експлантатів через 30 днів | ||
| штук | % | штук | % | ||||
| 1 2 3 | 1:4 | 10 15 30 | | | | | |
| 4 5 6 | 1:3 | 10 15 30 | | | | | |
| 7 8 9 | 1:2 | 10 15 30 | | | | | |
| 10 11 12 | 1:1 | 10 15 30 | | | | | |
^ Робота 7. Стерилізація меристем
Мета роботи: підібрати оптимальні умови стерилізації апікальних меристем суниці, отримати стерильну культуру суниці.
^ Матеріали і обладнання: рослини суниці, мильний розчин, концентрований розчин “Білизни”, стаканчики для стерилізуючих розчинів, мірний циліндр, стерильна дистильована вода, пробірки з живильним середовищем МС з додаванням 0,8 мг/л БАП, чашки Петрі зі стерильним фільтрувальним папером, стерильні чашки Петрі, нейлон, пінцети, очні пінцети, скальпелі, очні скальпелі, леза, препарувальні голки, спиртівка, спирт, бінокулярний мікроскоп, ламінар-бокс.
^ ХІД РОБОТИ
1. Приготувати розчини “Білизни” різної концентрації ( робота 4 ).
2. З вусиків суниці зрізати верхівки довжиною 1,5-2 см.
3. Експлантати промити проточною, а потім мильною водою.
4. Очистити бруньки від покривних листків і лусок і загорнути у нейлонові мішечки по 10 штук у кожний.
5.Мішечки з рослинним матеріалом помістити у стаканчики з стерилізуючими розчинами відповідної концентрації на відповідний час ( табл. 11 ).
6. Промити рослинний матеріал у трьох порціях стерильної дистильованої води (по 5 хв у кожній порції).
7. Стерильним пінцетом перенести один мішечок до стерильної чашки Петрі. Акуратно його розгорнути пінцетами.
Таблиця 11
| № п/п | Концентра-ція “Білизни” | Тривалість стерилізації (хв) | Загальна кількість експланта-тів (штук) | Кількість асептичних експлантатів через 6 днів | Кількість рослин-регенеран-тів через 30 днів | |
| штук | % | |||||
| | 1:4 | 10 15 30 | | | | |
| | 1:3 | 10 15 30 | | | | |
| | 1:2 | 10 15 30 | | | | |
| | 1:1 | 10 15 30 | | | | |