Мусієнко М. М., Панюта О. О. Біотехнологія рослин. Навчальний посібник
| Вид материала | Документы |
- Ослин навчальний посібник до лабораторних занять з фізіології рослин для студентів, 2678.12kb.
- Удк 581. 8 (075. 8) Брайон О. В., Панюта О. О., Паршикова Т. В., Славний, 518.84kb.
- Практикум з педагогіки вищої школи: Навчальний посібник за модульно-рейтинговою системою, 411.72kb.
- Дмитриченко М. Ф., Навчальний посібник, 2529.95kb.
- Дмитриченко М. Ф., Навчальний посібник, 2842.03kb.
- Наталя Чабан навчальний посібник з історії української культури мвс україни, 9171.9kb.
- Програма вступних фахових випробувань за спеціальністю «фізіологія рослин» освітньо-кваліфікаційний, 164.35kb.
- Рекомендовано Міністерством освіти України як навчальний посібник для студентів архітектурних, 1979.84kb.
- Т. Г. Сабірзянов Печі ливарних цехів. Гриф «Навчальний посібник», 375.04kb.
- Н. М. Борівська Навчальний посібник містить цікавий матеріал стосовно урок, 283.61kb.
^ ХІД РОБОТИ
1. Банку з рослиною протерти спиртом і обпалити горло у полум’ї спиртівки.
2. Стерильним пінцетом витягти рослину тютюну із банки і помістити її у стерильну чашку Петрі.
3. Притримуючи рослину пінцетом, скальпелем обрізати листки.
Верхівку рослини тютюну з апікальною меристемою доцільно помістити у банку з середовищем для рослин МС.
4. Окремий листок перенести у стерильну чашку Петрі і нарізати на сегменти площею 0,5-1,0 см2.
5. Листкові експлантати помістити на середовище для стеблового органогенезу МКР-1.
6. Культивувати при 250С+10С і 16-годинному фотоперіоді.
7. Через 2-3 тижні починається формування стеблових бруньок.
8. Через 3-4 тижні відокремити окремі великі бруньки і преренести на середовище МС для отримання паростків. Умови культивування ті ж.
Робота 15. Ризогенез із листкових дисків тютюну
Мета роботи: отримати культуру коренів тютюну із листкових дисків.
^ Матеріали і обладнання: рослини тютюну, вирощені in vitro, баночки зі стерильним середовищем МС, чашки Петрі з середовищем МКР-2 (табл. 15 ), стерильні чашки Петрі, скальпелі, пінцети, спирт, спиртівка, парафілм, ламінар-бокс.
^ ХІД РОБОТИ
1. Банку з рослиною протерти спиртом і обпалити горло у полум’ї спиртівки.
2. Стерильним пінцетом витягти рослину тютюну із банки і помістити її у стерильну чашку Петрі.
3. Притримуючи рослину пінцетом, скальпелем обрізати листки.
Верхівку рослини тютюну з апікальною меристемою доцільно помістити у банку з середовищем для рослин МС.
4. Окремий листок перенести у стерильну чашку Петрі і нарізати на сегменти площею 0,5-1,0 см2.
5. Листкові експлантати помістити на середовище для ризогенезуМКР-2.
6. Культивувати при 250С+10С і 16-годинному фотоперіоді.
7. Через 2 тижні спостерігається поява коренів.
Робота 16. Прямий ембріогенез
Мета роботи: отримати соматичні ембріоїди шляхом прямого ембріогенезу і проростити з них рослини моркви.
^ Матеріали і обладнання: 70%-й розчин спирту, стаканчики із стерильною дистильованою водою, концентрований розчин “Білизни”, стаканчик для стерилізуючого розчину, мірний циліндр, насіння моркви, чашки Петрі з середовищем для рослин МС, колби Ерленмейера з рідким середовищем МКР-3 (табл. 15 ), чашки Петрі зі стерильним фільтрувальним папером, стерильні чашки Петрі, марля, пінцети, скальпелі, спиртівка, спирт для стерилізації інструментів, парафілм, фольга, ламінар-бокс, шейкер.
^
ХІД РОБОТИ
Робота складається з кількох послідовних етапів.
Етап 1. Стерилізація і пророщування насіння моркви.
1. Простерилізувати насіння моркви (робота 4).
Умови стерилізації: витримати 2 хв у 70% етанолі, потім 15 хв – у розчині “Білизни” (1:3), тричі промити стерильною дистильованою водою (по 10 хв).
2. Стерильним пінцетом перенести насіння на безгормональне середовище МС у чашки Петрі.
3. Чашки закрити парафілмом і підписати.
4. Чашки з насінням культивувати у термостаті при 270-280С протягом двох тижнів.
Етап 2. Індукція ембріогенезу.
1. Стерильним пінцетом перенести проростки моркви у чашки Петрі.
2. Притримуючи проросток пінцетом, скальпелем порізати гіпокотиль на сегменти довжиною 0,5-1,0 см.
3. Сегменти гіпокотилів перенести у колби з рідким середовищем МКР-3.
4. Закрити колби кришками з фольги і підписати.
5. Колби з рослинним матеріалом культивувати у темряві при 270-280С на шейкері при 100 об/хв протягом трьох діб.
Етап 3. Утворення ембріоїдів.
1. Через 3 доби стерильним пінцетом дістати сегменти гіпокотилів із колби і відмити у двох порціях стерильної дистильованої води (по 10 хв).
2. Для підсушування стерильним пінцетом перенести рослинний матеріал у стерильну чашку Петрі з фільтрувальним папером.
3. Розкласти експлантати у чашки Петрі з агаровим середовищем МС.
4. Чашки закрити і підписати.
5. Чашки з рослинним матеріалом культивувати у термостаті при 270-280С. Через 3-4 тижні утворюються соматичні ембріоїди.
Етап 4. Пророщування ембріоїдів.
1. Через 3-4 тижні експлантати з ембріоїдами перенести у стерильну чашку Петрі.
2. Скальпелем відокремити соматичний ембріоїд і перенести у чашку Петрі з агаровим безгормональним середовищем МС.
3. Чашки з рослинним матеріалом культивувати при 280С і 16-годинному фотоперіоді.
Робота 17. Непрямий ембріогенез
Мета роботи: отримати соматичні ембріоїди шляхом непрямого ембріогенезу і проростити з них рослини моркви.
^ Матеріали і обладнання: рослини моркви, вирощені in vitro, чашки Петрі з середовищем МКР-4 (табл. 15), чашки Петрі з середовищем МКР-5 (табл. 15), баночки з середовищем МС, стерильні чашки Петрі, скальпелі, пінцети, спирт, спиртівка, парафілм, ламінар-бокс.
^ ХІД РОБОТИ
Отримання рослин шляхом непрямого ембріогенезу передбачає послідовну зміну відповідних стадій культивування:
1. Індукція проембріогенної калюсної маси.
2. Розвиток ембріоїдів.
3. Проростання ембріоїдів і формування рослин.
Тому робота складається з кількох етапів, які відповідають стадіям культивування.
Етап 1. Індукція проембріогенної калюсної маси.
1. Стерильним пінцетом витягти рослину із пробірки і помістити її у стерильну чашку Петрі.
2. Притримуючи рослину пінцетом, скальпелем відрізати листки моркви і розрізати черешки листків на сегменти довжиною близько 1 см.
3. Рослинні експлантати помістити у чашки Петрі з калюсогенним середовищем МКР-4.
4. Закрити чашки парафілмом і підписати.
5. Чашки з рослинним матеріалом культивувати у термостаті при температурі 270С протягом 1-2 місяців.
Етап 2. Розвиток ембріоїдів.
1. Експлантат з калюсом помістити у стерильну чашку Петрі.
2. Скальпелем відділити калюс від експлантата і поділити на рівні фрагменти.
3. Шматочки калюсу перенести на свіже живильне середовище МКР-5.
4. Чашки закрити і підписати.
5. Чашки з калюсом культивувати у термостаті при 270С.
6. Один раз на місяць необхідно пересаджувати калюсну тканину на свіже живильне середовище.
При вирощуванні в цих умовах через 4-6 тижнів починається формування ембріоїдів.
Етап 3. Пророщування ембріоїдів і формування рослин.
1. Через 8-10 тижнів калюс з ембріоїдами перенести у стерильну чашку Петрі.
2. Скальпелем відокремити зрілий ембріоїд від калюсної маси і помістити на агарове безгормональне середовище МС.
У баночку поміщають по 3 ембріоїди.
3. Банки з рослинним матеріалом культивувати при 280С і 16-годинниму фотоперіоді.
4. За цих умов вирощування через 6-8 тижнів із соматичних ембріоїдів виростуть рослини
культура ізольованих протопластів вищих рослин
Робота 18. Виділення і культивування ізольованих протопластів вищих рослин
^ Мета роботи: оволодіти методикою виділення і культивування протопластів із мезофілу листка; отримати ізольовані протопласти із мезофілу листка рослин картоплі.
^ Матеріали і обладнання: асептичні рослини картоплі, ферментні препарати - Cellulysin, Macerase, Driselase, глюкоза, сахароза, ксилоза, манітол, CaCl2·2H2O, NaCl, KCl, NH4NO3, KNO3, MgSO4·7H2O, KH2PO4, NH4Cl, FeSO4·7H2O, Na2ЕДТА·2H2O, H3BO3, MnCl2·4H2O, ZnSO4·7H2O, CuSO4·5H2O, CoSO4·7H2O, KI, Na2MoO4·2H2O, мезоінозит, гліцин, нікотинова кислота, фолієва кислота, біотин, аденін сульфат, гідролізат казеїну, тіамін, піридоксин, ІОК, НОК, 2,4-Д, БАП, зеатин, 1N KOH, агар, стакани на 200 мл, мірні циліндри, мірні піпетки, пастерівські піпетки, чашки Петрі діаметром 60 мм і 100 мм, колби Ерленмейера на 250 мл і 50 мл, колбочки зі скляними лійками і нейлоновими фільтрами (діаметр пор 50-100 мкм), центрифужні пробірки з гумовими пробками, шприц з насадкою з фільтрами “Millipore” з діаметром пор 0,22 мкм або 0,45 мкм, стерильний фільтр Зейтца, ваги, шпателі, пінцети, скальпелі, лезо у держаку, магнітний змішувач, рН-метр, настільна центрифуга, інвертований мікроскоп, плитка, автоклав, ламінар-бокс, спиртівка, вата, фольга, спирт, парафілм.
^ ХІД РОБОТИ
Робота складається з кількох етапів.
Етап 1. Підготовка до досліду.
1. Приготувати середовище виділення протопластів SI: 0,5 М розчин сахарози з 5 мМ CaCl2.
2. Приготувати середовище W-5 для відмивання протопластів (табл. 16).
3.Приготувати середовище W-S-S для культивування мезофільних протопластів картоплі ( табл. 16).
Для культивування мезофільних протопластів тютюну використовують середовище К-3 ( табл. 16 ).
4. Приготувати середовища ST-1, ST-2 і ST-3 ( табл. 16).
Для регенерації рослин тютюну використовують середовище RMOP (табл. 16).
5. Простерилізувати середовища.
6. Простерилізувати посуд для досліду:
Таблиця 16
Середовища для виділення і культивування протопластів картоплі і тютюну та регенерації з них рослин (мг/л)
| Компоненти | W-5 | K-3 | W-S-S | ST-1 | ST-2 | ST-3 | RMOP |
| NaCl | 9000 | | | | | | |
| NH4NO3 | | 250 | 1280 | | | 1650 | 1650 |
| KNO3 | | 2500 | | 1900 | 1900 | 1900 | 1900 |
| CaCl22H2O | 18400 | 900 | 600 | 440 | 440 | 440 | 440 |
| MgSO47H2O | | 250 | 300 | 370 | 370 | 370 | 370 |
| KH2PO4 | | | 170 | 170 | 170 | 170 | 170 |
| KCl | 800 | | 300 | | | | |
| Na2PO4H2O | | 150 | | | | | |
| (NH4)2SO4 | | 134 | | | | | |
| NH4Cl | | | | 267 | 267 | | |
| Fe-хелат | | 250 | 250 | 250 | 250 | 250 | 250 |
| H3BO3 | | 3 | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 |
| ZnSO47H2O | | 2 | 10 | 10 | 10 | 8.6 | 10 |
| CuSO45H2O | | 0.025 | 0.025 | 0.025 | 0.025 | 0.025 | 0.025 |
| CoCl26H2O | | 0.025 | 0.025 | 0.025 | 0.025 | 0.025 | 0.025 |
| KI | | 0.75 | 0.83 | 0.83 | 0.83 | 0.83 | 0.83 |
| Na2MoO42H2O | | 0.25 | 0.25 | 0.25 | 0.25 | 0.25 | 0.25 |
| MnSO4H2O | | 10 | 10 | | | | |
| MnSO44H2O | | | | 22.3 | 22.3 | 22.3 | 22.3 |
| Мезоінозит | | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| Гліцин | | | | 2 | 2 | 2 | |
| PP | | 1 | 1 | 5 | 5 | 5 | |
| Фолієва кислота | | | | 0.5 | 0.5 | 0.5 | |
| Біотин | | | | 0.05 | 0.05 | 0.05 | |
| Аденін сульфат | | | | 40 | 80 | 40 | |
| Гідролізат казеїну | | | 500 | 300 | 100 | | |
| В1 | | 10 | 10 | 0.5 | 0.5 | 1 | 10 |
| В6 | | 1 | 1 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 1 |
| ІОК | | | | | 0.1 | | 0.1 |
| НОК | | 0.2 | 2 | 1 | | | |
| 2,4-Д | | 1 | 0.2 | | | | |
| БАП | | 0.2 | 0.5 | 0.5 | | | 1 |
| Зеатин | | | | | 0.5 | | |
| Сахароза | | 10000 | | 2500 | 2500 | 25000 | 10000 |
| Глюкоза | 1000 | | 72000 | | | | |
| Ксилоза | | | 250 | | | | |
| Манітол | | 72800 | | 54600 | 36400 | | |
| Агар | | | | 1% | 1% | 0.7% | 0.7% |
| pH | 5,7 | ||||||
- середовище стерилізувати фільтруванням
- у сушильній шафі: чашки Петрі діаметром 60 мм і 100 мм, колби Ерленмейера на 50 мл закриті фольгою, пастерівські піпетки,
- у автоклаві: колбочки зі скляними лійками з нейлоновими фільтрами, центрифужні пробірки з гумовими пробками, шприц з насадкою для фільтрування, фільтр Зейтца.
Етап 2. Приготування ферментних розчинів
і ферментація тканин.
1. Приготувати ферментну суміш, яка містить 1% Cellulysin, 0,5% Macerase і 0,1% Driselase в середовищі виділення.
^ Для ферментації мезофілу тютюну використовують суміш, яка містить 0,5% Cellulase, 0,5% Macerase і 0,2% Driselase.
Калюсну тканину картоплі і тютюну ферментують у суміші, яка містить 1-2% Cellulase, 0,5-1% Macerase, 0,5-1% Driselase. Для ферментації варто брати свіжий і м’який калюс, який розсипається у ферментній суміші.
2. Відцентрифугувати суміш 10-15 хв при 2 тис. об/хв для осадження нерозчинних частинок.
3. Довести 1N КОН рН ферментної суміші до 5,6.
4. У боксі за допомогою шприца з насадкою з фільтром “Millipore” профільтрувати суміш у стерильну колбу Ерленмейера.
5. Розлити стерильний ферментний розчин по 7-10 мл в колби Ерленмейера на 50 мл.
Ферментні розчини краще готувати безпосередньо перед дослідом або за добу до досліду.
6. У боксі дістати із пробірки 4-тижневі рослини картоплі і помістити їх у стерильні чашки Петрі.
7. Притримуючи рослини пінцетом, скальпелем обрізати листки.
8. Акуратно притримуючи листки пінцетом, щоб не пошкодити мезофіл, лезом , закріпленим у держаку, нарізати їх тонкими ( до 1 мм завширшки) смужками.
9. Листкові смужки помістити на поверхню ферментної суміші у колби Ерленмейера, щоб тканина покривала всю поверхню суміші ( 1 г тканини на 10 мл ферментної суміші).
10. Колби з рослинним матеріалом помістити у термостат на 16 год при температурі 260С.
Оптимальну температуру і час інкубації необхідно підбирати для кожного конкретного випадку.
Етап 3. Виділення та очищення ізольованих протопластів.
1. Після інкубації додати у колби з рослинним матеріалом такий же об’єм середовища виділення.
2. Тотальний препарат протопластів профільтрувати через нейлонову сітку, щоб позбутися немацерованих шматочків тканини і елементів провідної системи.
3. Фільтрат стерильною піпеткою перенести у центрифужні пробірки ( 4/5 об’єму пробірки).
4. На фільтрат по стінці пробірки акуратно за допомогою піпетки нашарувати середовище W-5 ( 1/5 об’єму). Закрити пробірки і відцентрифугувати при 100 g 3 хв.
5. Поки йде центрифугування, у чисті центрифужні пробірки налити середовище W-5 ( 4/5 об’єму ).
6. З центрифугату акуратно відібрати стерильною піпеткою верхній шар, в якому містяться протопласти, які флотували на межі середовищ, і перенести у центрифужні пробірки з середовищем W-5 і відцентрифугувати при 80 g 3 хв.
7. Піпеткою акуратно відібрати надосадову рідину.
8. Відмивання протопластів проводимо ще раз.
Етап 4. Культивування ізольованих протопластів
і регенерація рослин.
1. У стерильні чашки Петрі ( діаметр 60 мм ) налити 2-3 мл середовища для культивування ізольованих протопластів W-S-S.
2. 2-3 краплі густої суспензії протопластів у середовищі W-5 піпеткою перенести в чашки Петрі з середовищем W-S-S.
3. Культивувати протопласти на розсіяному світлі при температурі 250+10С. Щодоби спостерігати за розвитком протопластів під інвертованим мікроскопом.
4. Після утворення клітинних колоній ( через 8-10 діб ) до суспензії клітин додати свіже живильне середовище W-S-S і в міру розведення суспензії частину колоній з середовищем перенести в нові чашки Петрі.
5. Колонії, які досягли розмірів 0,5-1 мм перенести на агарове середовище ST-1 для формування мікрокалюсів. Культивувати на світлі 3-4 клк при 16-годинному фотоперіоді.
6. Через 10-15 днів яскраво-зелені колонії діаметром 1-3 мм перенести на середовище ST-2 для органогенезу і культивувати при 250С, 16-годинному фотоперіоді і освітленні 3-4 клк 25-30 днів.Часто для регенерації рослин необхідно повторно пересаджувати колонії на свіже середовище ST-2.
7. Сформовані пагони висотою 3-10 мм відділити від калюсу і перенести на безгормональне середовище ST-3 для вкорінення.
Оформлення роботи: замалювати ізольовані протопласти і клітинні колонії, описати калюси і рослини-регенеранти.
^ СЛОВНИК ТЕРМІНІВ