Учебное пособие составлено в соответствии с программой по биохимии для студентов всех факультетов медицинских вузов. Оно предназначено для самостоятельной подготовки студентов и оптимизации их работы на практических занятиях
| Вид материала | Учебное пособие |
СодержаниеРабота 1. Определение активности щелочной фосфатазы в крови. Ход работы. Принцип метода Ход работы. Работа 3. Определение общего азота в эмали и дентине зуба. Ход работы. Вопросы к занятию |
- Предлагаемое учебное пособие предназначено для студентов, аспирантов и преподавателей, 2052.38kb.
- Учебное пособие для самостоятельной работы студентов ставрополь 2007, 1394.43kb.
- Учебное пособие по дисциплине «Сестринское дело в хирургии» составлено в соответствии, 2118.11kb.
- Учебно-методическое пособие для самостоятельной работы студентов интернов по специальности, 390.76kb.
- Учебное пособие томск 2009, 1504.09kb.
- Учебное пособие Чебоксары 2007 удк 32. 001 (075. 8) Ббк ф0р30, 1513.98kb.
- Учебное пособие М.: Педагогическое общество России. 1999 442, 5623.86kb.
- Учебное пособие для самостоятельной работы студентов специальности 040600 «Сестринское, 1354.95kb.
- Новые поступления в библиотеку экономическая теория, 225.89kb.
- Учебное пособие Ставрополь 2005 удк 577. 1 (075. 8) Бкк 28. 072, 277.1kb.
Креатинфосфокиназа /КК/ обладает органоспецифичностью и содержится в большом количестве в мышечной, сердечной и мозговой тканях. В норме активность креатинфосфокиназы в крови очень мала. Определение активности КК и ее изоформ в крови используется в медицине для диагностики таких заболеваний, как инфаркт миокарда, мышечные дистрофии и др.
Работа 1. Определение активности щелочной фосфатазы в крови.
ОБОРУДОВАНИЕ: ФЭК, центрифуга.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Фосфатазы - ферменты, отщепляющие остаток фосфорной кислоты от ее органических эфирных соединений. В зависимости от рН, при котором проявляется их большая ферментативная активность, различают кислую и щелочную фосфатазы. Кислая фосфатаза активна при рН 4,4 - 6,2, а щелочная фосфатаза имеет оптимум рН 8,6 - 10.
Эти ферменты поступают в кровь из костной ткани, печени, почек, селезенки, предстательной железы.
Щелочная фосфатаза вызывает гидролиз моноэфиров ортофосфата в щелочной среде рН=9,0. В качестве субстрата для щелочной фосфатазы используют глицерофосфат, от которого под действием фермента гидролитическим путем отщепляется фосфор. По количеству неорганического фосфата, образованного в процессе гидролиза, судят об активности фермента. Фосфор определяют колориметрическим методом по реакции с молибденовым реактивом в присутствии восстановителя - аскорбиновой кислоты. Продукт реакции - молибденовый синий дает синее окрашивание раствора, интенсивность окраски которого прямо пропорциональна количеству фосфора в пробе.
Активность щелочной фосфатазы увеличивается при болезнях печени, например при механической желтухе. Резко возрастает при рахите и аденоме.
ХОД РАБОТЫ.
В двух центрифужных пробирках приготовить смесь реактивов по последующей схеме:
-
№№ пробирок
глицерофос-фатный буфер, рН = 8,92
сыворотка крови
Инкубация
1 час
1
опыт
5.0 мл
0.5 мл
37оС
2 контроль
5.0 мл
0.5 мл
Комнатная tо
Первая пробирка служит для определения суммарного неорганического фосфата, включающего фосфор, гидролизованный щелочной фосфатазой.
Вторая пробирка - для определения негидролизованного неорганического фосфата, содержащегося в сыворотке.
После инкубации к обеим пробиркам прилить по 4,5мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Содержимое пробирок центрифугировать при 3000 об/мин в течение 10 минут.
В чистые пробирки отобрать по 3 мл безбелкового центрифугата и провести цветную реакцию на фосфор - добавить в каждую пробирку по 1 мл молибденового реактива и 1 мл 1% раствора аскорбиновой кислоты. Оставить стоять 15 мин. при комнатной температуре для развития окраски.
Измерение оптической плотности обеих пробирок провести на ФЭКе при красном светофильтре (670 нм) в кюветах толщиной 0,5 см против воды.
Используя разность экстинкций (Д1 - Д2), определить по калибровочному графику количество фосфора (в мг), разложившегося под действием щелочной фосфатазы в единицах активности (единицы Боданского - ВЕ). Эту величину умножить на 200. За единицу активности щелочной фосфатазы у взрослых принимают прирост 1 мг фосфата на 1 мл сыворотки.
Нормальная активность щелочной фосфатазы у взрослых 2 -5 ВЕ,
у детей -5 - 15 ВЕ.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
ВЫВОДЫ: (сравнить полученные результаты с нормой)
Работа 2. Определение активности креатинкиназы в мышечной ткани и в сыворотке крови.
ПРИНЦИП МЕТОДА
Метод основан на том, что в щелочной среде реакция
Креатин+АТФ4 - АДФ3 -+Креатинфосфат+Н+
сопровождается выделением ионов Н+. Регистрируя изменения рН в процессе реакции ( до и после инкубанции), можно оценить активность фермента.
ХОД РАБОТЫ.
1. Приготовить смесь реактивов:
1,5 мл креатина, 1,0 мл АТФ,
1,0 мл трис- буфера (рН = 7,4),
0,5 мл гомогената мышечной ткани (или сыворотки крови).
2. Определить исходный уровень рНо инкубационной смеси на иономере.
3. Поместить пробирку с инкубационной смесью в термостат на 45 минут.
4. Через 45 минут после термостатирования определить рН1 инкубационной среды.
5. Вычислить разницу показателей рНо - рН1= рН.
По величине полученной разницы найти активность креатинкиназы с помощью калибровочного графика. Активность фермента /КК/ выражена в условных единицах. За условную единицу принимается количество фермента, высвобождающего 1мкг экв.Н+/за 45 минут, что сопряжено с высвобождением 1 мкМ АДФ.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
ВЫВОДЫ: (сравнить активность КК в крови и в мышечной ткани)
Работа 3. Определение общего азота в эмали и дентине зуба.
ОБОРУДОВАНИЕ: ФЭК.
ПРИНЦИП МЕТОДА.
Определение общего азота производится в минерализате эмали и дентина зуба. При минерализации все азотсодержащие органические вещества переходят в форму сульфата аммония. Взаимодействие сульфата аммония с реактивом Несслера, в состав которого входят соли ртути, дает желто-оранжевое окрашивание, интенсивность которого прямо пропорционально концентрации азота.
ХОД РАБОТЫ.
В мерную пробирку на 10 мл, содержащую минерализат эмали (дентина), добавить дистиллированную воду немного более половины пробирки (6-7
мл). Перемешать !
В эту же пробирку добавить 0,4 мл заранее отмеренного в другой пробирке реактива Несслера, затем довести объем пробирки дистиллированной водой до уровня 10 мл. Снова тщательно перемешать (осадок недопустим!). Приготовленная таким образом смесь остается на 10 минут для развития окраски, после чего содержимое пробирки колориметрируется на ФЭКе с синим светофильтром (440 нм) против воды в кюветах на 10 мм.
Расчет количества общего азота производится по калибровочному графику, построенному по раствору сульфата аммония. Сравнить результаты определения концентрации общего азота в эмали и дентине.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
ВЫВОДЫ:
ВОПРОСЫ К ЗАНЯТИЮ:
1. Коллаген - специфический белок соединительной ткани. Особенности химического состава. Структурная организация. Участие витамина С в созревании коллагена. Экскреция оксипролина - показатель скорости распада коллагена.
2. Эластин, его свойства, химический состав и молекулярная структура.
3. Протеогликаны - основные белки межклеточного вещества соединительной ткани, значение, структурная организация. Гликозамингликаны, структура и функция.
Для стоматологического факультета:
4. Химический состав минерализованных тканей. Апатиты. Особенности строения и свойств различных типов апатитов.
5. Особенности минерального состава зуба (эмали, дентина, цемента).
6. Белки кости и зуба. Коллаген. Строение коллагена. Процессинг коллагена. Особенности коллагена костной ткани.
7. Неколлагеновые белки кости: протеогликаны, гликопротеины, остеонектин, остеокальцин и др. Ферменты кости.
8. Небелковые органические компоненты кости и зуба. Роль цитрата в метаболизме костной ткани.
9. Пульпа зуба. Ее биохимическая характеристика.
10. Теория минерализации кости и зуба.
11. Белковые регуляторные факторы остеогенеза (митогены, морфогены, хемиатрактанты, антагонисты митогенов и морфогенов).
12. Гормоны - регуляторы остеогенеза. Паратгормон и кальцитонин, их влияние на обмен кальция и фосфора.
13. Витамины группы Д. Провитамины. Роль витамина Д в поддержании гомеостаза кальция.
14. Влияние питания на состояние зубов. Роль пищевых белков, углеводов, микроэлементов и витаминов.
15. Микроэлементы: фтор, стронций, их значение для минерализации кости и зуба. Патологические состояния, связанные с неоптимальным поступлением в организм.
Для лечебного, педиатрического, медико-профилактического и фармацевтического факультетов:
16. Миофибриллярные и саркоплазматические белки мышечной ткани и их значение. Характеристика миозина, актина, тропонина, тропомиозина. Особенности строения и молекулярной организации.
17. Биохимический механизм мышечного сокращения и расслабления. Роль ионов кальция и АТФ в регуляции мышечного сокращения.
18. Источник ресинтеза АТФ в мышечной ткани. Роль креатинкиназного механизма в регенерации АТФ при мышечной работе.
19. Особенности химического состава и метаболизм сердечной мышцы.