Факторы риска и контроль вирусных инфекций после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток у детей 14. 01. 21 гематология и переливание крови 14. 01. 08 педиатрия

Вид материала

Научная новизна
Практическое значение
Положения, выносимые на защиту
Внедрение в практику
Апробация диссертации
Структура и объем диссертации
Содержание работы
Всего ПАЦИЕНТОВ
Эпштейн-Барр вирусная инфекция
Тактика дополнительного вирусологического обследования
Сorbett Research
Лабораторная диагностика других вирусных патогенов
Результаты исследования и их обсуждение

Подобный материал:

1 2 3 4 5

Научная новизна

Представленная работа является первым проспективным исследованием, проведенным в Российской Федерации, посвященным научному обоснованию и оптимизации методов контроля вирусных инфекций у пациентов после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток.
Впервые представлен анализ частоты реактивации различных вирусных инфекций и приведены доказательства важности контроля вирусных осложнений характерных для реципиентов после неродственной и гаплоидентичной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. Достоверное снижение частоты Эпштейн-Барр вирусной инфекции и ассоциированных с ней осложнений в течение не менее одного года после гаплоидентичной трансплантации отмечается у пациентов, которым проведена дополнительная В-клеточная деплеция трансплантата.
Определена и интерпретирована клиническая значимость отдельных факторов риска развития вирусных инфекций после трансплантации, что необходимо для адекватного контроля данной группы осложнений. В частности, было доказано, что помимо вида трансплантации важное клиническое значение играют тяжесть острой реакции трансплантат против хозяина и длительный терапевтический курс глюкокортикоидов.
Было также продемонстрировано, что источник гемопоэтических стволовых клеток не влияет на частоту реактивации вирусных инфекций. Было впервые продемонстрировано, что применение трансплантата от ЦМВ-серонегативного донора при адекватном и правильном применении упреждающей терапии не влияют на частоту и сроки реактивации цитомегаловирусной инфекции, однако это увеличивает вероятность развития у пациента ЦМВ-пневмонии, а профилактическое использование ганцикловира не является эффективным и, следовательно, нецелесообразно.
Выявлены наиболее эффективные подходы к диагностике вирусных инфекций после трансплантации для правильной и своевременной оценки клинической ситуации, а также определена их значимость для выбора оптимального терапевтического алгоритма. В частности, продемонстрирована высокая эффективность упреждающей терапии, основанной на рутинном скрининге ПЦР в режиме «реального времени» для контроля ЦМВ и ЭБВ инфекций. Выявлена возможность использования качественной ПЦР для адекватной диагностики аденовирусной (АДВ) инфекции. Доказано отсутствие необходимости рутинного скрининга герпес вируса 6 типа после трансплантации.
Использование разработанного протокола упреждающей терапии для контроля ЦМВ и ЭБВ инфекций позволяет контролировать показатели выживаемости пациентов в независимости от уровня виремии у пациентов после трансплантации. В данном исследовании было также продемонстрировано, что АДВ инфекция достоверно уменьшает вероятность выживаемости пациентов после трансплантации, а обнаружение герпес вируса 6 типа не влияет на прогноз пациентов.
В исследовании впервые была продемонстрирована роль геморрагического цистита и доказана его связь с плохим прогнозом у пациентов после ТГСК. Было показано, что геморрагический цистит является полиэтиологическим осложнением, где решающим является комбинированный эффект целого ряда факторов риска, таких как ВК-вирурия, миелоаблативный режим кондиционирования, применение циклофосфамида, а также реактивация ЦМВ и ЭБВ инфекций. Впервые было продемонстрировано, что острая реакция трансплантат против хозяина не является провокационным фактором для развития геморрагического цистита. Была также опровергнута роль ВК-вирусной инфекции, как изолированного фактора риска развития данного осложнения.

Практическое значение

Основное практическое значение работы заключается в установлении частоты, структуры, особенностей течения и выделения групп риска широкого спектра вирусных инфекций у реципиентов ТГСК. Важным результатом явилось научное обоснование результатов и внедрение в практику протоколов профилактики и лечения больных.

Контроль ЦМВ инфекции основан на использовании метода упреждающей терапии, где большое внимание уделяется раннему выявлению виремии с помощью ПЦР в режиме «реального времени». Клинический опыт применения такой тактики позволяет говорить о ее эффективности.

Отсутствие результата от проведения профилактического курса ганцикловира стали поводом для исключения его из протокола противовирусной профилактики перед ТГСК, что вероятнее всего позволит снизить финансовые затраты на терапию реципиентов ТГСК и избежать потенциальной фармакологической токсичности.

Нами были получены данные об эффективном контроле ЭБВ-инфекции у реципиентов гаплоидентичных ГСК посредством дополнительной В-клеточной деплеции с помощью иммуномагнитной селекции или ритуксимаба. Учитывая эффективность такого подхода, мы рекомендуем его для активного использования в клинической практике.

В нашем исследовании была продемонстрирована эффективность альтернативных методов терапии ЭБВ-ПТЛЗ при рефрактерности к ритуксимабу и рекомендовано незамедлительное начало полихимиотерапии, которая является эффективным вариантом продолжения лечения у таких пациентов. Кроме того, в исследовании была показана выполнимость и эффективность проведения клеточной терапии ЭБВ-ПТЛЗ с использованием ЭБВ-специфических донорских лимфоцитов.

Несмотря на необходимость широкого внедрения количественной ПЦР диагностики аденовирусной инфекции, мы продемонстрировали возможность применения качественной методики ПЦР диагностики. Однако, в этом случае адекватная интерпретация возможна исключительно после тщательного анализа клинической ситуации.

Полученные нами результаты дают основание сделать вывод об отсутствии клинической значимости применения качественной ПЦР диагностики для выявления данного патогена, так как мы не получили данных о прогностическом значении полученных результатов.

Полученные результаты при анализе предрасполагающих факторов развития геморрагического цистита свидетельствуют о необходимости расширенного вирусологического мониторинга, учитывая высокую вероятность комбинированного вирусного поражения уротелия.

Результаты анализа факторов риска, особенностей реактивации и течения вирусных инфекций у пациентов после аллогенной ТГСК являются чрезвычайно важными, учитывая тяжесть вирусассоциированных осложнений у данной категории пациентов. Полученные результаты и разработанные на их основании алгоритмы контроля вирусных инфекций являются значимым этапом в большой клинико-исследовательской работе, направленной на улучшение качества жизни и прогноза пациентов после ТГСК.

Положения, выносимые на защиту

В структуре вирусных инфекций у реципиентов аллогенных ТГСК преобладают ЦМВ (51,8%), ЭБВ (26,9%) и АДВ инфекции (28,2%). Клинически значимыми факторами риска развития вирусных для большинства вирусных инфекций являются неродственная и гаплоидентичная трансплантации, острая и хроническая РТПХ, интенсивная иммуносупрессивная терапия во время кондиционирования и в посттрансплантационном периоде.
Проявления ЦМВ-инфекции, а также ее тяжесть зависят от таких факторов, как серологический ЦМВ-статус донора и реципиента, интенсивность и длительность иммуноаблативной терапии, развитие острой и хронической РТПХ, контроль контаминации трансфузируемых сред. Виремия и положительная ПЦР являются предвестниками висцеральной ЦМВ-инфекции, в частности ЦМВ-пневмонии.
Наиболее высокая вероятность висцеральных ЦМВ-инфекций характерна для пациентов, трансплантированных от ЦМВ-серонегативного донора. Новый подход к контролю ЦМВ инфекции с использованием методов упреждающей терапии, основанной на раннем выявлении виремии с помощью ПЦР в режиме «реального времени» и начале терапии ганцикловиром в доклиническую фазу, позволяет значительно сократить вероятность клинических ЦМВ-инфекций. Благодаря такой тактике прогноз выживаемости у пациентов, реактивировавших ЦМВ после ТГСК, не отличается от прогноза пациентов без признаков реактивации.
Проявления ЭБВ-инфекции и вероятность развития ЭБВ-ассоциированного лимфопролиферативного заболевания зависят от степени Т-клеточной аблации, связанной с иммуносупрессивной терапией или Т-клеточной деплецией трансплантата, проводимой при гаплоидентичной ТГСК, а также от проявлений острой РТПХ. Эффективным методом профилактики ЭБВ инфекции при гаплоидентичной ТГСК является дополнительная В-клеточная деплеция трансплантата посредством иммуномагнитной селекции или ритуксимаба.
Своевременная диагностика ЭБВ-ПТЛЗ требует проведения рутинного мониторинга вирусной ДНК как минимум 2 мес. после проведенной трансплантации, а в группах высокого риска – дольше, то есть длительность мониторинга определяется индивидуально с учетом клинической ситуации. Проведение упреждающей терапии ритуксимабом является оптимальным методом профилактики ЭБВ-ПТЛЗ. Рефрактерность к ритуксимабу со стороны ЭБВ-ПТЛЗ должно являться поводом для проведения полихимиотероапии и клеточной терапии специфическими лимфоцитами.
Проявления АДВ-инфекции зависят от вида трансплантации, где наиболее значимой является гаплоидентичная ТГСК, а также от проявлений острой РТПХ. АДВ инфекция достоверно влияет на показатели выживаемости пациентов, что требует чрезвычайно внимательного отношения к данной проблеме. При отсутствии технических возможностей количественного измерения вирусной нагрузки, качественное измерение АДВ-ПЦР может быть эффективным при правильной интерпретации полученных результатов, где достоверными являются результаты ПЦР, подтвержденные повторным вирусологическим исследованием, а также лабораторные данные, свидетельствующие о наличии АДВ в нескольких различных исследуемых средах.
Использование качественной методики ПЦР для диагностики вируса герпеса 6 типа не является эффективным методом, позволяющим отработать адекватный алгоритм для контроля данного заболевания. Несмотря на то, что существует достоверная связь между вирусом герпеса 6 типа и острой РТПХ, влияние данной инфекции на прогноз пациентов после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток отсутствует.
Геморрагический цистит является полиэтиологичным осложнением у пациентов после ТГСК. Наибольшая частота развития геморрагического цистита свойственная для реципиентов гаплоидентичной ТГСК (45%). ВК-вирус не является изолированной проблемой, влияющей на развитие геморрагического цистита. Развитие геморрагического цистита связано с комбинированным действием ряда факторов, таких как интенсивность кондиционирования, использование циклофосфамида, АДВ и ЦМВ инфекция. Частота развития данного осложнения не зависит от проявлений острой РТПХ, хотя течение острой РТПХ на фоне геморрагического цистита значительно ухудшает прогноз у пациентов после ТГСК по сравнению с пациентами без геморрагического цистита.
У реципиентов ТГСК могут быть другие вирусные инфекции (риновирус, парагрипп, коронавирус и др.) являются причиной тяжелых жизнеугрожающих инфекций. Частота их развития не является высокой, однако вероятность их развития возможна в течение длительного срока (не менее 12 мес) после ТГСК. Изоляция пациента после ТГСК от контактов с носителями инфекции и соблюдение асептического режима являются одной из наиболее эффективных мер профилактики.

Внедрение в практику

Результаты исследования внедрены в работу ФГУ ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии Минздравсоцразвития России и ГУ Российской детской клинической больницы Минздравсоцразвития России. Основные положения и выводы диссертации используются в подготовке специалистов гематологов, онкологов и иммунологов на кафедре онкологии и гематологии ГОУ ВПО РГМУ Минздравсоцразвития России. По теме диссертации опубликовано 33 работ, в том числе 31 в научных журналах, рекомендованных в перечне ВАК для публикации диссертационных работ.

Результаты работы доложены Российском съезде гематологов и трансфузиологов (Москва, 2006), на IV-VI Международных симпозиумах «Биологические основы терапии гематологических и онкологических заболеваний» (Москва, 2005, 2007, 2009), на V Совете экспертов Восточно-Европейской группы по вакцинопрофилактике (Москва, 2007), VIII-X Рабочих совещаниях руководителей детских онкогематологических центров и отделений субъектов Российской Федерации (Москва, 2007, 2008, 2009), на лекционных курсах в рамках образовательных программ для врачей региональных онкогематологических центров (Екатеринбург, 2007; Санкт-Петербург, 2005; Москва, 2009), на I Объединенном научно-практическом форуме детских врачей (Орел, 2008), на Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы детской трансплантологии» (Минск, 2010).

Апробация диссертации

Диссертация апробирована на совместной научно-практической конференции сотрудников клинических и лабораторных отделов ФГУ ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии Минздравсоцразвития России и ГУ Российской детской клинической больницы Минздравсоцразвития России 29 декабря 2010 года.

Структура и объем диссертации

Материал изложен в одном томе на __ страницах машинописного текста, содержит __ таблицу и проиллюстрирован __ рисунками. Указатель литературы включает __ источника. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы.

Работа выполнена в ФГУ ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии Минздравсоцразвития России (директор – член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Румянцев А.Г.) на базе ГУ Российская детская клиническая больница Минздравсоцразвития России (главный врач – доктор медицинских наук, профессор Ваганов Н.Н.).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Основные характеристики пациентов и особенности проводимой ТГСК

В исследование были включены 157 пациентов в возрасте от 1 до 17 лет, получивших аллогенную ТГСК от родственного или альтернативного донора в период с 25 января 2006 г. по 27 января 2010 г. в отделении трансплантации костного мозга (зав.отделением – доктор медицинских наук Скоробогатова Е.В.) ФНКЦ ДГОИ на клинической базе ГУ Российской детской клинической больницы Минздравсоцразвития России. Сбор информации о состоянии пациентов был остановлен 01 апреля 2010 г.

Всего было проведено 175 ТГСК у 157 пациентов. Больные были разделены на группы в соответствие с видом проводимой ТГСК:

ТГСК от родственного НLA-идентичного донора (n=54) или родственного донора несовместимого с пациентом по одному HLA-антигену (n=4).
ТГСК от неродственного НLA-идентичного донора (n=79) или неродственного донора несовместимого с пациентом по одному HLA-антигену (n=13).
ТГСК от родственного гаплоидентичного донора (n=25).

В исследование вошли больные с различными онкологическими, гематологическими, иммунологическими и генетическими заболеваниями (табл.1). Показания к проведению ТГСК определялись в соответствии с общепринятыми критериями для проведения данного метода терапии (Румянцев А.Г., Масчан А.А., 2003).

Таблица 1. Характеристика больных по нозологическим формам и видам ТГСК

Нозологические формы	ТГСК от неродственного донора	ТГСК от родственного донора	Гаплоидентичная ТГСК	Всего
Гемобластозы	47	32	17	96
Первичные иммунодефициты	5	1	1	7
Солидные опухоли	0	0	1	1
Врожденные и приобретенные депрессии кроветворения	21	17	0	38
Генетические заболевания	13	1	0	14
Гемоглобинопатии	0	1	0	1
Всего ПАЦИЕНТОВ	86	52	19	157
Всего ТГСК	92	58	25	175

У пациентов, которым проводилась ТГСК от неродственного донора, было использовано несколько режимов кондиционирования. У пациентов с гемобластозами высокого риска и при наследственных заболеваниях использовались режимы кондиционирования на основе Бусульфана (БУ), доза которого варьировала от 20 мг/кг (у детей до 3 лет) до 16 мг/кг. У пациентов с анемией Фанкони доза БУ была снижена до 4 мг/кг (в одном случае 2 мг/кг) с целью редукции органной токсичности и РТПХ, что обусловлено особенностями основного заболевания. В ряде случаев применялся структурный аналог БУ - Треосульфан в дозе 42 г/м². У пациентов с острым миелобластным лейкозом (ОМЛ) промежуточного риска использовался мод

ифицированный режим кондиционирования, где основным миелоаблативным агентом являлся Мельфалан (Мельф) в дозе 180 мг/м². У двух пациентов с острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ), трансплантированных от неродственного донора, миелоаблация была достигнута с помощь тотального облучения тела (ТОТ) в дозе 12 Грей. У пациентов с апластической анемией (АА) перед неродственной ТГСК или при наличии гиперсенсебилизации, использовалось торако-абдоминальное облучение (ТАО) в дозе 2 Грей.

Основные принципы выбора режима кондиционирования были схожи при различных видах ТГСК. Различия заключались в том, что интенсивная иммуноаблация с использованием антитимоцитарного глобулина или алемтузумаба во время кондиционирования проводилась либо при неродственной ТГСК, либо при наличии у пациента парциально совместимого донора (в том числе при гаплоидентичной трансплантации).

В качестве источников ГСК использовался костный мозг (КМ), периферическая кровь (ПСКК) или пуповинная кровь (ПК) (табл. 2).

Таблица 2. Источники гемопоэтических стволовых клеток при различных видах проводимой ТГСК

Источники ГСК	ТГСК от неродственного донора	ТГСК от родственного донора	Гапло-ТГСК	Всего
Костный мозг	70	37	0	107
Периферическая кровь	12	21	25	58
Пуповинная кровь	10	0	0	10

Поиск неродственного донора проводился немецким регистром неродственных доноров «Stefan Morsch Stiftung» в соответствие с договором о проведении данной работы между данной организацией и ФНКЦ ДГОИ. При появлении необходимости подбора неродственного донора проводилось HLA-типирование методом высокого разрешения в лаборатории ФНКЦ ДГОИ, после чего проводился предварительный скрининг в международной базе данных. Затем ДНК пациента отправлялась в «Stefan Morsch Stiftung» для проведения подтверждающего типирования. При выявлении в международной базе данных нескольких HLA-идентичных доноров проводился отбор наиболее оптимального из них с учетом таких факторов как пол, возраст, группа крови, инфекционный-статус (в первую очередь ЦМВ-статус). Забор неродственного КМ или ПСКК проводился не позднее, чем за 36 часов от трансплантации.

Образцы для девяти из 10 неродственных трансплантаций клеток пуповинной крови были подобраны и предоставлены «Банком стволовых клеток Департамента здравоохранения г.Москвы» (главный врач - Яковлева М.В.).

Диагностика острой РТПХ проводилась в соответствии с международной классификацией (табл. 3,4). При необходимости подтверждения диагноза острой РТПХ проводилась биопсия пораженного участка и гистологическое исследование препарата.

Для профилактики острой РТПХ назначался циклоспорин А (при родственной ТГСК) или такролимус (при неродственной РТПХ) в сочетании с микофенолата мофетилом. При наличии острой РТПХ 2-3 стадии назначалась терапия стероидными глюкокортикоидами в дозе 1-2 мг/кг/сутки в расчете по преднизолону в качестве терапии первой линии. Длительность терапии стероидами составляла как минимум 10 дней после разрешения всех симптомов острой РТПХ с постепенным снижением дозы на 25% в неделю. В случае развития острой РТПХ, рефрактерной к терапии стероидами (отсутствие полного разрешения всех симптомов в течение 7 дней терапии, либо отсутствие улучшения клинического состояния больного в течение 3 дней терапии, либо прогрессия заболевания на фоне терапии), больные получали лечение с использованием высоких доз стероидов (5-10 мг/кг/сут), моноклональных антител (инфликсимаб, алемтузумаб), циклофосфамида.

Таблица 3. Степень органного поражения при острой РТПХ (Przepiorka D., 1995)

Степень	Кожа	Печень	Кишечник
Степень	Пятнисто-папулезная сыпь, поверхность тела, %	Билирубин ммоль/л	Диаррея (мл/м² в сутки)
1	<25%	34-51	300-500
2	25-50%	51-102	500-1000
3	> 50% или генерализованная эритродермия	102-255	>1000
4	Буллезный эпидермолиз	>255	Сильная боль или илеус

Таблица 4. Критерии тяжести острой РТПХ (Rowlings P., 1997)

Стадия	Степень
Стадия	Кожа	Печень	ЖКТ
I – легкая	+/++	-	-
II – умеренная	+/+++	+	+
III – тяжелая	++/+++	++/+++	++/+++
IV – жизнеугрожающая	++/++++	++/++++	++/++++

Проявления хронической РТПХ характеризуются клиническими изменениями, патогномоничными для ряда аутоиммунных заболеваний с поражением в первую очередь соединительной ткани (табл. 5).

Согласно клинико-патологической классификации хроническая РТПХ подразделялась на локализованную и экстенсивную формы. Локализованная форма характеризовалась ограниченным кожным поражением или печеночной дисфункцией, а экстенсивная форма хронической РТПХ - генерализованным поражением кожи или печеночной дисфункцией в сочетании с локальным поражением кожи, или одним из этих параметров в сочетании с хроническим активным гепатитом или циррозом печени, поражением глаз, поражением слюнных желез и слизистых рта, вовлечением других органов.

Таблица 5. Клинические изменения, характерные для хронической РТПХ (Atkinson K, 2000).

Органы/системы	Клинические проявления
Кожа	Диспигментация, ксероз, эритема, склеродерма, ониходистрофия, алопеция
Слизистые рта	Лихеноиды
Глаза	Дакриоцистит, кератит
Печень	Гипербилирубинэмия, холестаз
Легкие	Обструктивные/рестриктивные изменения
Влагалище	Стеноз, атрофия
Суставы	Контрактуры, бурситы, артриты
Другие	Потеря веса, анорексия

Лечение хронической РТПХ включало в себя длительную иммуносупрессивную терапию (преднизолоном 1-2 мг/кг/сут, циклоспорином А 1-3 мг/кг/сут, микофенолата мофэтилом 30 мг/кг/сут), а также симптоматическую сосудистую и местную терапию, фотоферез лимфоцитов крови.

Мониторинг, терапия и профилактика вирусных инфекций у реципиентов ТГСК

Цитомегаловирусная инфекция

Перед проведением ТГСК проводился рутинный скрининг всех доноров и пациентов на ЦМВ методом ИФА для определения их серологического статуса. Целью данного обследования являлось определение степени риска развития или реактивации ЦМВ инфекции, что являлось необходимым для определения тактики мониторинга и профилактики ЦМВ инфекции. На основании данных обследования была особо выделена группа сверхвысокого риска, куда были отнесены серопозитивные пациенты (ЦМВ IgG pos), получившие трансплантат от серонегативного донора (ЦМВ IgG neg). В эту же группу были включены все пациенты, которым проводилась гаплоидентичная ТГСК (независимо от серологического статуса донора и пациента).

В связи с невозможностью скрининга и отбора серонегативных доноров компонентов крови, все трансфузируемые препараты (тромбоконцентрат и эритромасса) проходили лейкофильтрацию с помощью лейкоцитарных фильтров IV поколения (Bio R1 Plus “Fresenius”, Германия). Трансфузия фильтрованных препаратов проводилась абсолютно всем пациентам, независимо от группы риска развития ЦМВ.

С +1 по +28 день всем пациентам назначался ацикловир в дозе 750 мг/м²/сут внутривенной инфузией. В дальнейшем осуществлялся перевод пациента на пероральную форму ацикловира или на валацикловир, терапия которым продолжалась как минимум до +120 дня (при необходимости дольше). Поводом для продолжения терапии являлась дисфункция трансплантата, недостаточная иммунореконституция, интенсивная иммуносупрессивная терапия или РТПХ.

Кроме того, всем пациентам проводился мониторинг содержания иммуноглобулинов сыворотки и назначались заместительные трансфузии препаратами внутривенных иммуноглобулинов (ВВИГ) при снижении концентрации IgG ниже 4-5 г/л.

С января 2006 г. по январь 2009 г. у всех пациентов, отнесенных в группу сверхвысокого риска (серонегативный донор ГСК, а также при гаплоидентичной ТГСК) проводились дополнительные меры, направленные на профилактику ЦМВ инфекции: с -8 по -1 день (то есть во время проведения кондиционирования) назначался ганцикловир в/в в дозе 10 мг/кг/сут. С января 2009 г., учитывая данные промежуточного анализа с группой исторического контроля, такая терапия проводилась только у пациентов перед гаплоидентичной ТГСК и не проводилась у пациентов с ЦМВ-серонегативным донором.

Для своевременного раннего выявления и контроля ЦМВ у всех пациентов после ТГСК проводился регулярный лабораторный количественный мониторинг ЦМВ методом ПЦР. Исследование проводилось один раз в неделю не менее 2 мес после ТГСК, либо дольше, в случае пролонгированной иммуносупррессии, РТПХ или наличии других факторов риска.

Лабораторные признаки ЦМВ виремии являлись поводом для проведения упреждающей терапии ганцикловиром. При неродственной и гаплоидентичной трансплантации показанием для начала вирусостатической терапии являлась ЦМВ виремия, независимо от количественных показателей ДНК ЦМВ в крови; при проведении ТГСК от родственного донора ганцикловир назначался при >1000 копий ДНК ЦМВ/мл крови. В ряде случаев вопрос о начале упреждающей терапии решался индивидуально на основании оценки имеющихся у пациента факторов риска.

Критерием прекращения упреждающей терапии являлось однократное получение негативного результата ПЦР исследования.

Лечени висцеральных ЦМВ-инфекций проводилось в соответствие со следующим алгоритмом:

Ганцикловир - доза 10 мг/кг/сут (2 х 5 мг/кг) не менее 2 недель.
Фоскавир 180 мг/кг/сут (2 х 90 мг/кг или 3 х 60 мг/кг) при отсутствии положительной динамики виремии на терапии ганцикловиром.

При тяжелой форме органного поражения возможно проведение комбинированной терапии: Ганцикловир + Фоскавир.

Сидофовир (1 мг/кг/ 3 раза в неделю) при неэффективности ганцикловира и фоскавира при отсутствии положительной динамики через 2 недели.
При выявлении у ребенка ЦМВ-пневмонии: комбинация проводимой вирусостатической терапии с высокими дозами ВВИГ.

Так как препараты Фоскавир и Сидофавир не зарегистрированы на территории Российской Федерации, они использовались исключительно в соответствии с регламентирующими нормативными документами: информированным согласием родителей пациента или его официального опекуна, утверждением Этического комитета и Ученого Совета ФНКЦ ДГОИ, а также решением консилиума в составе не менее трех специалистов.

Критериями прекращения терапии ЦМВ-заболевания являлись двукратное получение негативного результата ПЦР исследования и нормализация клинического состояния пациента.

Эпштейн-Барр вирусная инфекция

Большинство доноров и пациентов также были обследованы на ЭБВ посредством ИФА, в особенности в группах высокого риска (неродственная ТГСК, гаплоидентичный донор).

У двадцати двух из 25 пациентов, имевших гаплоидентичных доноров, проводилась иммуно-магнитная селекция с использованием CD3+CD19+ (n=21) или CD4+CD8+CD19+ (n=1) моноклональных антител. Применение данного метода позволяло деплетировать дополнительно CD19+ клон для редукции вероятности В-клеточной пролиферации.

Кроме того, при использовании во время кондиционирования ритуксимаба в связи с клинической ситуацией, его инфузия перед ТГСК являлась профилактической мерой для предотвращения развития ЭБВ инфекции. В двух случаях инфузия ритуксимаба накануне трансплантации (день -1) при использовании гаплоидентичного донора была использована в расчете исключительно на профилактику ЭБВ инфекции.

С целью своевременного выявления и контроля ЭБВ проводился рутинный лабораторный количественный мониторинг ЭБВ методом ПЦР.

Принятие решения о начале упреждающей терапии в большинстве случаев решалось индивидуально с учетом имеющихся факторов риска. Наличие у пациента массивной иммуноаблативной терапии, использование методов Т-клеточной деплеции, применение неродственного трансплантата и аплазия кроветворения являлись основанием для начала упреждающей терапии даже при низком титре ДНК-ЭБВ в крови (1000 - 5000 копий/мл).

У пациентов после родственной ТГСК от HLA-идентичного донора низкий титр ДНК-ЭБВ являлся основанием для упреждающей терапии только при удвоении количества копий при еженедельном мониторинге.

Упреждающая терапия проводилась посредством назначения ритуксимаба в дозе 375 мг/м² с интервалом в неделю. Лечение прекращалось после получения негативного результата ПЦР диагностики, но не раньше, чем после 2-4 введений ритуксимаба.

Лечение ЭБВ-ПТЛЗ проводилось также с помощью препарата ритуксимаб в дозе 375 мг/м² еженедельно не менее 4 введений.

При большом объеме опухоли и резистентности к ритуксимабу принималось решение о проведении программной химиотерапии.

Тактика дополнительного вирусологического обследования

Другие группы вирусных инфекций и иные среды для их выявления не были предметом рутинного мониторинга. Обследование выполнялись по мере необходимости, т.е. появления клинической симптоматики, являющейся характерной для того или иного возбудителя с учетом особенностей иммунного статуса пациента.

Появление признаков макрогематоурии или клинических признаков цистита являлось поводом для определения уровня ВК-вирурии, а в некоторых случаях - ЦМВ и АДВ в моче.

Появление признаков поражения верхних дыхательных путей являлись поводом для взятия мазка на группу респираторных вирусов. При подозрении на поражение ЦНС исследовалась цереброспинальная жидкость. Кроме того, активно исследовались биоптаты кожи и биоптаты слизистой различных отделов ЖКТ, а также смывные воды, полученные во время бронхо-альвеолярного лаважа (БАЛ).

Таким образом, вопрос об объеме проведения и направлении на вирусологическое обследования нередко решался индивидуально с учетом особенностей клинической симптоматики и факторов риска у каждого конкретного пациента.

Лабораторный мониторинг. Особенности используемой ПЦР диагностики.

Проведение ПЦР диагностики ЦМВ, ЭБВ и АДВ проводилось в условиях лаборатории ДНК-диагностики ФНКЦ ДГОИ.

Лабораторная диагностика ЦМВ и ЭБВ проводилась с помощью набора реагентов «АмплиСенс® CMV-Монитор-FL» и «АмплиСенс EBV-скрин-титр-FL» (ИнтерЛабСервис, Россия). Наборы реагентов использовались в соответствие со стандартной методикой утвержденной Росздравнадзором и изложенной в инструкции, входящей в состав набора реагентов.

Лабораторная диагностика АДВ производилась с помощью набора реагентов «GenPak® DNA test; вариант ADV, gen» (Isogene Lab, Россия), также на основании стандартной методики, представленной в инструкции к набору.

Реакция амплификации проводилась на аппарате «Rotor-Gene 6000» ( Сorbett Research, Австралия) в соответствие с инструкцией по эксплуатации прибора и рекомендациями производителя. Перед проведением процедуры прибор программировался для выполнения соответствующей программы амплификации и детекции флуорисцентного сигнала (в соответствие с поставленной задачей), согласно описанию для данного прибора.

Лабораторная диагностика других вирусных патогенов

Исследование биоптатов, мазков, БАЛ-жидкости и других сред на предмет качественного определения герпетических вирусов и вирусов респираторной группы проводилась в лаборатории ФГБУ ГНЦРФ Института Иммунологии Федерального медико-биологического агентства.

Исследование сред на предмет обнаружения ВК-вируса проводилось в ООО "Медицинский центр "Авиценна"(Москва, Россия).

В данных лабораториях применялись отработанные в этих учреждениях методы вирусологической ПЦР-диагностики, которые соответствовали существующим стандартам.

Статистическая обработка данных

Клинические данные о пациентах и особенностях течения их заболеваний, а также данные вирусологического мониторинга стали основой для разработки базы данных, оптимизированной для анализа полученных результатов. База данных была создана оригинальная компьютерная база основных показателей на основе программы «Microsoft Office Excel 2007».

Данные представлены в виде средних величин либо медиан, с указанием разброса и среднестатистического отклонения. Бессобытийная выживаемость определена для всех пациентов как продолжительность наблюдения от даты начала терапии (выполнения аллогенной ТГСК) до рецидива основного заболевания, отторжения трансплантата, констатации первичного неприживления или смерти. В том случае, если ни одно из перечисленных событий не наступило к моменту окончания исследования, при построении кривой цензурировалась дата последнего наблюдения в ремиссии; это же правило распространялось на пациентов, выбывших из исследования - цензурировалась дата последнего наблюдения. Общая и бессобытийная выживаемость оценивались по методу Каплана-Майера. Несмотря на то, что у части пациентов было проведено две и более ТГСК, общая и бессобытийная выживаемость рассчитывались исключительно от момента первой трансплантации, проведенной у пациента (т.е. без учета последующих трансплантаций).

Сравнение показателей выживаемости проводилось с использованием Log-Rank теста. Анализ таблиц сопряженности проводился с помощью критерия «χ²».

При сравнении полученных данных уровень достоверности был принят равным р=0,05. Полученные данные обработаны с использованием программного обеспечения StatSOFT 7.1 для Windows (StatSoft Russia, www.statsoft.ru).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Blog

Факторы риска и контроль вирусных инфекций после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток у детей 14. 01. 21 гематология и переливание крови 14. 01. 08 педиатрия

Научная новизна