Президента Российской Федерации (по адресу: 103875, Москва, ул. Воздвиженка, д ) Сдиссертацией можно ознакомиться в библиотеке фгу «унмц» уд президента РФ по адресу: 121359, Москва, ул. Маршала Тимошенко,21. автореферат
| Вид материала | Автореферат |
- Президенте Российской Федерации по адресу: 119606, Москва, пр. Вернадского, 84, корп., 244.77kb.
- Государственном Научном Центре колопроктологии по адресу: 123423, г. Москва, ул. Саляма, 285.81kb.
- Государственном Медицинском Университете по адресу: 117997 г. Москва, ул. Островитянова,, 594.23kb.
- Правительстве Российской Федерации по адресу: 117218, г. Москва, ул. Большая Черемушкинская,, 389.57kb.
- Шмидта Российской Академии Наук (ифз ран) по адресу; Москва 123995, ул. Большая Грузинская,, 658.55kb.
- Правительстве Российской Федерации по адресу: 117218, г. Москва, ул. Большая Черемушкинская,, 385.47kb.
- Российском Государственном Медицинском Университете по адресу: 117997, г. Москва, ул., 514.67kb.
- Министерства Здравоохранения Российской Федерации по адресу: 644043 г. Омск ул. Ленина, 737.51kb.
- Бурденко Министерства Обороны Российской Федерации ( г. Москва, Госпитальная площадь,, 279.6kb.
- Всероссийской Академии Внешней Торговли по адресу: 119285, г. Москва, улица Пудовкина,, 320.49kb.
Наблюдается тенденция к увеличению MeF75 (с39,4±8,5 до 51,0±12,4) и MeF50 (с 32,7±7,6 до 41,7±10,8), что свидетельствует о положительном действии ингаляций ультранизких доз Циклоспорина А. При этом отсутствие достоверной динамики скоростных показателей дыхания в группе ЦсА, вероятно, обусловлено тем, что пациенты находились в стадии ремиссии бронхиальной астмы и имели показатели, близкие к лучшим персональным данным до исследования.
При проведении ингаляций ЦсА значимого роста RAW, не зафиксировано, что свидетельствовало об отсутствии ирритативного эффекта ЦсА.
3.2.3 Оценка эндоскопической картины бронхиального дерева.
Описание динамики эндоскопической картины в группе Циклоспорина А представлено в Таблице 10.
Рисунок 5
В группе ЦсА наблюдается тенденция к уменьшению гиперемии (с 0,5±0,2 до 0,1±0,1), отека (с 1,6±0,3 до 1,1±0,4), количество секрета не меняется (до лечения 1,8±0,4, после 1,8±0,3), вязкость и характер секрета существенно не изменяются (с 1,5±0,4 до 1,3±0,2 и с 1,3±0,3, до 1,0±0,0 соответственно). Интерпретация полученных данных представляет определенные сложности из-за малого количества пациентов, которым была проведена бронхоскопия (Рисунок 5).
Представленные данные свидетельствуют о том, что добавление ингаляций ультра-низких доз ЦсА к терапии стабильной БА не имеет местнораздражающегося действия.
3.2.4 Исследование клеточного и гуморального иммунитета.
При фентипировании лимфоцитов периферической крови значимых изменений уровней CD3+, CD4+, CD8+, CD20+, CD16+, CD95+клеток в группе ЦсА выявлено не было, что свидетельствует об отсутствии иммунодепрессивного действия ингаляций ультранизких доз ЦсА на лимфоцитарное звено иммунной системы (Рисунок 6).
Рисунок 8
При применении ингаляций ультра-низких доз Циклоспорина-А наблюдается стойкая тенденция к снижению экспрессии CD25 (легкая цепь рецептора к ИЛ-2) с 3,5±1,2 до 1,3±0,5, (не достигшая статистической достоверности из-за малого количеств наблюдений), что свидетельствует об уменьшении активации лимфоцитов периферической крови.
Всем пациентам после проведенной терапии было выполнено исследование фагоцитарного звена иммунитета. Сравнительный анализ показателей до и после лечения представлен в Таблице 10.
Таблица 10.
Показатели фагоцитарного звена иммунитета группы ЦсА до и после лечения
| Показатель | Норма | До лечения | Через 14 дней |
| ФАН % | 70,0±2,2 | 40,6±2,5 | 47,2±2,9* |
| ФЧ | 5,5±0,4 | 3,9±0,4 | 5,3±0,5** |
| ФР % | ____ | 10,8±1,6 | 15,0±3,0 |
| НСТ % спонтанный | 15,0±0,7 | 17,8±1,4 | 19,8±1,6 |
| НСТ % стимулир. | 55,0±3,5 | 54,3±2,2 | 62,2±2,4 |
| ИС | 5,5±0,2 | 3,6±0,4 | 3,3±0,2 |
*-изменение показателя достоверно по сравнению с исходным (р<0,002)
**-изменение показателя достоверно по сравнению с исходным (р<0,02)
Анализируя таблицу 10 можно сделать вывод, что после проведенного лечения у пациентов группы ЦсА наблюдается тенденция к увеличению фагоцитарного резерва и статистически значимое увеличение фагоцитарной активности нейтрофилов с 40,6±2,5 до 47,2±2,9 (р<0,002) и фагоцитарного числа с 3,9±0,4 до 5,3±0,5 (р<0,02). Это свидетельствует об иммуномодулирующем влиянии ингаляций ЦсА на фагоцитарное звено иммунной системы и об отсутствии иммунодепрессивного действия.
В ходе работы были исследованы уровни цитокинов в сыворотке крови. Результаты исследования представлены в Таблице 11. Анализируя таблицу 36 можно сделать вывод, что в сыворотке крови пациентов группы Циклоспорина А после проведенного курса ингаляций наблюдается тенденция к снижению уровня растворимого рецептора к ИЛ-2 (что является важным, так как ЦсА блокирует выработку ИЛ-2), в то время как уровни ИФН- после лечения не отличаются от исходных значений.
Таблица 11.
Динамика уровня цитокинов в крови пациентов группы ЦсА (пкг/мл)
| Показатель | До лечения | После лечения |
| ИФН- | 2,1±0,3 | 2,1±0,3 |
| ИЛ-2р | 590,3±64,9 | 495,0±38,6 |
3.2.5 Исследование безопасности ингаляций ЦсА
В развернутом анализе крови у пациентов группы ЦсА после проведенного лечения динамика отсутствует. При оценке биохимического анализа крови и общего анализа мочи у пациентов группы Циклоспорина А после лечения динамики по сравнению с исходными значениями не наблюдается, что позволяет исключить наличие побочных эффектов характерных для терапевтических концентраций ЦсА.
3.3 Исследование взаимосвязи клинических, иммунологических, эндоскопических и морфологических параметров.
Нами была прослежена взаимосвязь динамики показателей CD лимфоцитов и клинических проявлений. При проведении корреляционного анализа выявлена зависимость изменений CD95 и клинических признаков в группе Мф. При исследовании взаимосвязи динамики клинических показателей и CD маркеров выявлена корреляция таких клинических показателей как: кашель, тяжесть приступов и нарушение толерантности к физической нагрузке с CD95 у пациентов, получавших ингаляции ультра-низких доз Мелфалана, а также частоты приступов с CD8 и нарушение толерантности к физической нагрузке с CD20 у пациентов, получавших ингаляции ультра-низких доз Циклоспорина А. Выявленные корреляции являются прямыми - снижение показателей CD лимфоцитов сопровождается уменьшением степени выраженности клинических проявлений (Таблица 12).
Таблица 12
Коэффициент корреляции клинических показателей и CD лимфоцитов
| Показатель | Циклоспорин А | Мелфалан | |
| CD8 | CD20 | CD95 | |
| Кашель | - | - | 0,5 р<0,02 |
| Тяжесть приступов | - | - | 0,4 р<0,05 |
| Частота приступов | 0,5 р<0,05 | - | - |
| Нарушение толер. к физ. нагрузке | - | 0,6 р<0,02 | 0,5 р<0,02 |
В группе Мелфалана наблюдается достоверная прямая корреляция между CD95 и кашлем, тяжестью приступов и нарушением толерантности к физической нагрузке. Выявленные закономерности демонстрируют клиническую значимость снижения CD95 после лечения Мф, доказывая противовоспалительный эффект проводимой терапии.
Известно, что CD8(цитотоксические лимфоциты) являются основой противовирусного иммунитета, а CD20 (B-лимфоциты) - антибактериального иммунитета посредством дифференцировки в плазматические клетки с последующим синтезом антител. Выявленные закономерности при лечении ЦсА позволяют предположить, что повышение CD8 и CD20, возможно, связано с увеличением вирусной и бактериальной нагрузки, которая играет важную роль в развитии обострения при бронхиальной астме.
Таблица 13
Коэффициент корреляции эндоскопических признаков воспаления и CD95
| Показатель | Мелфалан |
| CD95 | |
| Вязкость секрета | 0,4 р<0,01 |
| Характер секрета | 0,4 р<0,02 |
При исследовании взаимосвязи динамики показателей CD лимфоцитов и эндоскопических признаков воспаления выявлена прямая корреляция CD95 с вязкостью секрета и характером секрета. При этом необходимо отметить, что зависимость является прямой - снижение CD95 сопровождается уменьшением степени выраженности эндоскопических признаков воспаления (Таблица 13).
Снижение уровня CD95, наблюдаемое у пациентов, получавших ингаляции ультранизких доз Мф свидетельствует об уменьшении активации клеток, снижении активности воспалительного процесса в бронхах и, как следствие уменьшении эндоскопических признаков воспаления.
При исследовании взаимосвязи динамики клинических показателей и показателей фагоцитоза выявлена корреляция таких клинических показателей как одышка с фагоцитарным числом в группе Мелфалана, а также частоты приступов с фагоцитарной активностью нейтрофилов и кашля, частоты использования 2-агонистов, частоты и тяжести приступов с фагоцитарным числом в группе Циклоспорина А. Необходимо отметить, что зависимость является обратной – увеличение показателей фагоцитоза сопровождается уменьшением степени выраженности клинических проявлений (Таблица 14).
Таблица14
Коэффициент корреляции клинических симптомов и показателей фагоцитоза
| Показатель | Циклоспорин А | Мелфалан | |
| ФАН | ФЧ | ФЧ | |
| Одышка | отсутствует | отсутствует | -0,4 р<0,05 |
| Кашель | отсутствует | -0,4 р<0,05 | отсутствует |
| Тяжесть приступов | отсутствует | -0,5 р<0,02 | отсутствует |
| Частота приступов | -0,6 р<0,02 | -0,7 р<0,002 | отсутствует |
| Частота использования 2-агонистов | отсутствует | -0,7 р<0,001 | отсутствует |
При исследовании взаимосвязи динамики показателей фагоцитоза и эндоскопических признаков воспаления в группе Мелфалана выявлена корреляция фагоцитарного числа с гиперемией слизистой бронхов, вязкостью и характером секрета. Необходимо отметить, что зависимость изменений фагоцитарного числа и эндоскопических признаков воспаления является обратной – увеличение фагоцитарного числа сопровождается уменьшением эндоскопических признаков воспаления (Таблица 15).
Таблица 15
Коэффициент корреляции эндоскопических признаков воспаления и показателей фагоцитоза
| Показатель | Мелфалан |
| ФЧ | |
| Вязкость секрета | -0,5 р<0,02 |
| Характер секрета | -0,5 р<0,02 |
Положительная динамика показателей фагоцитоза у пациентов, получавших ингаляции ультранизких доз Мелфалана и Циклоспорина А, вероятно, обусловлена противовоспалительным действием данных препаратов, что приводит к уменьшению воспалительных процессов и нормализации фагоцитарной функции. Можно также предположить, что прямое иммуномодулирующее действие Мф и ЦсА на фагоциты приводит к уменьшению бактериальной нагрузки, что также оказывает положительное влияние на клинику и эндоскопические признаки воспаления.
Полученные данные о взаимосвязях клинических, иммунологических, эндоскопических и морфологических показателей подтверждают важную роль активации лимфоцитарного звена и фагоцитарного звеньев иммунной системы в патогенезе БА и актуальность разработки новых методов терапии, направленных на коррекцию этих звеньев. Это позволяет рекомендовать проведение фенотипирования лимфоцитов и исследование фагоцитарной функции для мониторинга состояния пациентов и контроля эффективности терапии ингаляциями иммоундепрессивных препаратов с различным механизмом действия.
3.4 Результаты исследования влияния ультра-низких концентраций Мелфалана на биохимические показатели крови in vitro.
В ходе исследования, (Таблица 16) выявлено значительное повышение общей АТФазной активности при добавлении Мелфалана в низкой концентрации 0,1 мкг/мл (р<0,05). Повышение концентрации в 10 раз вызывало некоторое снижение активности данного фермента. Отмечено повышение активности Са,Мg-АТФазы при концентрации Мф 0,1 мкг/мл (р<0,05) и отсутствие каких-либо изменений при более высоких концентрациях.
Нами не выявлено достоверных изменений в интенсивности механического гемолиза эритроцитов (показатель, характеризующий жесткость/хрупкость мембран) под влиянием Мелфалана в группах №2 и 3.
При инкубации эритроцитов с высокими концентрациями Мф значимо увеличивался перекисный гемолиз эритроцитов (р<0,01) в группе №2 по сравнению с контролем (1,77±0,13 и 1,42±0,07, соответственно), при этом влияние малых доз препарата в группе №3 было менее выраженным.
При использовании Мф в дозе 0,1мкг/мл в группе №3 несколько снижалось содержание в них связанного МДА, уровень его не изменялся при введении больших доз препарата в группе №2. Изменение уровня свободного МДА в эритроцитах было разнонаправленным – повышалось при введении низких доз в группе №3 (0,75±0,19, р<0,01 по сравнению с контролем и группой №2), и достоверно снижалось под влиянием высоких концентраций Мф в группе №2 по сравнению с группой №1 (0,075±0,08 и 0,29±0,06, соответственно). В группе №3 снижение связанного и увеличение свободного МДА под воздействием Мф сопровождалось тенденцией к повышению активности Ca,Mg-АТФазы и снижению - Na,K-АТФазы.
Как известно, СОД является одним из самых активных антиоксидантов, и ее активность в клетках легких пациентов с БА обратно коррелирует с тяжестью заболевания (Smith, 1997). Важно отметить, что малые дозы Мф не влияли на активность СОД, а большие - на 40% снижали активность фермента (р<0,01) по сравнению с контролем.
Таблица 16.
Исследования влияния различных концентраций Мелфалана на биохимические показатели эритроцитов периферической крови in vitro (M±m).
| Параметр | Группа №1 контроль | Группа №2 1,0 мкг/мл | Группа №3 0,1 мкг/мл |
| Активность общей АТФазы | 276,15±10,86 | 257,8±10,24 | 284,6±14,84 * |
| Активность Ca/Mg-АТФазы | 256,65±11,33 | 256,3±15,25 | 273,1±12,87 *† |
| Активность Na/K-АТФазы | 36,25±6,39 | -5,05±7,51* | 32,95±9,58 |
| Механ. гемолиз эрироцитов | 0,915±0,16 | 1,01±0,18 | 0,96±0,1 |
| Перекис. гемолиз эрироцитов | 1,42±0,07 | 1,77±0,13* | 1,555±0,23 |
| МДА общий | 2,845±0,15 | 2,595±0,04 | 3,105±0,06 |
| МДА связанный | 2,49±0,12 | 2,495±0,07 | 2,35±0,16 |
| МДА свободный | 0,29±0,06 | 0,075±0,08 | 0,75±0,19 |
| СОД | 14,54±0,96 | 10,615±2,47*† | 15,39±1,18 |
| Mg2+ | 0,34±0,02 | 0,35±0,05 | 0,36±0,02* |
| Fe3+ | 25,4±1,04 | 24,93±3,65 | 24,25±2,45 |
| Cu2+ | 3,015±0,21 | 2,945±0,11 | 3,8±0,18*† |
| Zn2+ | 23,05±1,57 | 23,35±1,80 | 22,95±1,0 |
* - различия достоверны (p<0,05) между исследуемыми Группами №3 и 1;
† - различия достоверны (p<0,05) между Группой №2 и Группой №3
Выявлено незначительное повышение уровня свободного внутриэритроцитарного магния (Mgin) в группе №2 и более значительно повышение данного показателя в группе №3, достоверно (p<0,05) отличающееся от контроля (0,36±0,02 и 0,34±0,02 ммоль/л, соответственно).
При исследовании уровня Cu2+ и Zn2+ отмечено, что при применении низких доз Мелфалана в группе №3 увеличивалось содержание ионов меди по сравнению с контролем (3,8±0,18 и 3,015±0,21 ммоль/л, соответственно), в то время как концентрация цинка не менялась в группах.
Таким образом, проанализировав полученные данные, можно сделать заключение о различном дозозависимом действии различных концентраций алкилирующего препарата Мелфалан на эритроциты периферической крови. Концентрации, которые достигаются в организме при применении стандартных дозировок Мф в онкологической практике, приводят к усилению перикисного окисления липидов, увеличивая активность оксидантного стресса. При этом нами установлено, что ультра-малые концентрации, примененные нами в ходе клинического исследования, не только не оказывают отрицательного влияния на показатели перикисного окисления липидов, но и положительно действуют на активность общей , Ca,Mg-АТФаз и Na/K-АТФаз, что улучшает окисидантный-антиоксидантный статус и не оказывает цитопатогенного действия. В заключение можно сделать вывод о перспективности применения ультра-низких доз Мелфалана у пациентов с бронхиальной астмой для снижения оксидантного стресса.