Президента Российской Федерации (по адресу: 103875, Москва, ул. Воздвиженка, д ) Сдиссертацией можно ознакомиться в библиотеке фгу «унмц» уд президента РФ по адресу: 121359, Москва, ул. Маршала Тимошенко,21. автореферат

Вид материала

Подобный материал:

1 2 3 4 5

Все пациенты страдали персистирующей БА умеренной (30 пациентов) и тяжелой (26 пациентов) степени тяжести (согласно критериям GINA, 2002). Возрастной диапазон пациентов составлял от 30 до 70 лет (56,61,7). Средний срок заболевания 11,62,4 лет (от 2 до 30 лет). У всех пациентов зафиксирована обратимая бронхообструкция ΔFEV1>12% и 200 мл при проведении бронходилятационного теста с короткодействующим β2-агонистом по стандартной методике.

Критерии включения в исследование:

клинический диагноз бронхиальной астмы средней или тяжелой степени, в соответствии с классификацией тяжести астмы по GINA, 2002 года;
подписание информированного согласия на участие в исследовании;
возраст от 30 до 70 лет включительно;
пол – мужчины и небеременные женщины (мужчины и женщины с детородным потенциалом с эффективной контрацепцией);
Наличие прироста FEV1>12% и 200 мл при проведении фармакологической пробы с β2-агонистом при компьютерной спирометрии.
Возможность адекватно выполнять требования протокола исследования.

Критерии исключения из исследования:

пациенты, не подписавшие информированное согласие;
беременные, кормящие женщины или женщины с детородным потенциалом, не пользующиеся эффективной контрацепцией;
наличие в анамнезе указаний на использование иммунотропных препаратов за 6 месяцев до начала исследования;
неспособность оптимально выполнять спирометрию и заполнять дневник;
наличие атопической бронхиальной астмы;
муковисцидоз или бронхоэктатическая болезнь в анамнезе;
наличие клинически значимых сопутствующих заболеваний сердечно-сосудистой, эндокринной, нервной систем, печени, почек, которые по мнению исследователя могут повлиять на получаемые результаты;
аллергия, на какой либо из компонентов используемых препаратов

При изучении эффективности и безопасности ингаляций ультра-низких доз Мелфалана дополнительным критерием включения являлось наличие обострения БА, с острыми или подострыми эпизодами прогрессирующего ухудшения дыхания, кашля, хрипов, чувства заложенности в груди или их этих симптомов, при снижении PEF от 70%, но не более, чем до 25% от лучших показателей, что соответствовало умеренному и тяжелому обострению.

При изучении эффективности и безопасности ингаляций ультра-низких доз Циклоспорина А дополнительным критерием включения в исследование являлось наличие у пациента БА вне обострения как минимум в течение 4 недель до включения в исследование.

Для клинической характеристики пациентов использовался клинический индекс, включающий в себя следующие показатели: одышка, кашель, толерантность к физической нагрузке, частота и тяжесть приступов, частота использования ₂-агонистов. Вышеперечисленные показатели оценивались по четырехбальной системе; при этом, наибольшая выраженность признака соответствовала 3 баллам, а отсутствие признака – 0. Частота использования короткодействующих ₂-агонистов оценивалась по следующей схеме: 0 р/сут – 0 баллов, 1-3 р/сут – 1 балл, 4-6 р/сут – 2 балла, более 7 р/сут – 3 балла.

Интенсивность кашля оценивался по следующей шкале: 0 — нет; 1 — слабый кашель (незначительное покашливание по утрам); 2 — умеренный кашель (покашливание по утрам и на протяжении дня); 3 — сильный кашель.

Дизайн исследования по оценке эффективности и безопасности ингаляций ультра-низких доз Мелфалана у пациентов с обострением БА.

Исследование было организовано как одноцентровое, проспективное, рандомизированное, плацебо-контролируемое. Дизайн исследования представлен на Схеме 1.

Стандартная терапия обострений БА, осуществлялась в соответствие с рекомендациями GINA, 2002 года. После рандомизации 1:1 пациенты первой группы помимо стандартной терапии получали дополнительно ингаляции Мф (0,1 мг в 0,9% р-ре NaCl) в течение 5 дней (группа Мф). Пациенты второй группы помимо стандартной терапии получали ежедневные ингаляции плацебо (0,9% р-р NaCl) в течение 5 дней (контрольная группа).

Схема 1.

Дизайн исследования по оценке эффективности и безопасности ингаляций ультра-низких доз Мф при обострении БА.

Поступление пациентов в стационар по поводу обострения БА

Подписание формы информированного согласия

Верификация диагноза и степени тяжести заболевания согласно критериям GINA. Оценка адекватности предшествующей терапии.

Оценка критериев включения/исключения

Рандомизация пациентов на контрольную и основную группу в соотношении 1:1 методом конвертов.

Обследования до курса ингаляций

Пациенты основной группы помимо стандартной терапии получали ингаляции 0,1 мг Мелфалана в течение 5 дней

Пациенты контрольной группы помимо стандартной терапии получали ингаляции 0,9% физ.

р-ра в течение 5 дней

Проведение обследования через 5 дней курса ингаляций

Оценка клинического индекса через 3 месяца.

Наблюдение в течение 1 года

Разовая доза составляла 0,1 мг Мф, растворенного в 2 мл физиологического раствора (концентрация препарата в растворе 0,05 мг/мл). Раствор для ингаляции готовился непосредственно перед процедурой. Ингаляции проводились в течение 5 дней ежедневно 1 раз в сутки (курсовая доза 0,5 мг Мф).

В группе пациентов, включенных в исследование, 31 (67%) из 46 человек получали системные ГКС на постоянной основе. Суточная поддерживающая доза системных ГКС составляла от 5 до 20 мг (в среднем 8,75±3,81мг) в пересчете на преднизолон.

Контрольная группа состояла из 9 женщин и 13 мужчин в возрасте от 31 года до 69 лет (55,02,1), с давностью заболевания от 2 до 10 лет (6,21,2). Умеренно персистирующая БА выявлена у 50% пациентов, тяжелая - у 50%.

Группа Мф состояла из 12 женщин и 12 мужчин в возрасте от 38 до 69 лет (55,41,2), с давностью заболевания от 4 до 30 лет (12,72,5). Умеренно персистирующая БА выявлена у 45,5% пациентов, тяжелая - у 54,5%.

Группы Мелфалана и контроля были сопоставимы по полу, возрасту и клинической характеристике заболевания.

Дизайн исследования по оценке эффективности и безопасности ингаляций ультра-низких доз ЦсА у пациентов с БА стабильного течения.

Исследование было организовано как одноцентровое, пилотное, проспективное. Дизайн проведенного исследования представлен на Схеме 2.

Стандартная терапия БА стабильного течения проводилась в соответствие с GINA, 2002 года. Помимо стандартной терапии пациенты получали ингаляции ЦсА по 1 мг ежедневно в течение 5 дней.

Группа ЦсА состояла из 6 женщин и 4 мужчин в возрасте от 51 до 70 лет (63,72,3), с давностью заболевания от 5 до 20 лет (11,32,1). Умеренно персистирующая БА выявлена у 60% пациентов, тяжелая - у 40%.

В группе пациентов, включенных в исследование, 3 (30%) из 10 человек получали системные ГКС на постоянной основе. Суточная доза системных ГКС составляла от 5 до 10 мг (6,8±1,8 мг) в пересчете на преднизолон.

Ежедневно 1 раз в сутки в течение 5 дней выполнялись ингаляции 1 мг ЦсА, в 2 мл физиологического раствора (курсовая доза - 5 мг ЦсА).

Методика ингаляции Мф и ЦсА.

Согласно разработанной нами методике для ингаляций использовалась система для проведения бронхопровокационных проб («Bronchoscreen-II», Erich Eager, Германия), позволяющая определить точную дозу введенного препарата и контролировать уровень аэродинамического сопротивления /RAW/ методом перекрытия воздушного потока, для исключения местного ирритативного действия препарата. Все растворы готовились непосредственно перед ингаляцией, длительность которой составляла 30-40 минут до поступления заданной дозировки препарата к пациенту. Осуществлялся контроль бронхиальной проходимости (спирометрия или пикфлуометрия) до и после каждой ингаляции для исключения бронхоконстрикторного действия препарата.

Схема 2.

Дизайн исследования по оценке эффективности и безопасности ингаляций ультра-низких доз ЦсА при БА стабильного течения.

Подписание формы информированного согласия

Обследование до курса ингаляций

Пациенты помимо стандартной терапии получали ингаляции 1 мг ЦсА в течение 5 дней

Проведение обследования после лечения

Наблюдение в течение 6 месяцев

Методы исследования

Исследование проводилось с использованием лабораторных (общеклинических и специальных) и инструментальных методов: функциональных (спирометрия), рентгенологических, эндоскопических (фибробронхоскопия).

Исследования выполнены на базе Лаборатории пульмонологии НИМСИ, кафедры клинической иммунологии МГМСУ, Онкологического научного центра РАМН, Центра иммуногенетики РАМН, Российского кардиологического научно-производственного комплекса, ГКБ №70.

Обследование пациентов проводилось до лечения и через 5 дней после окончания курса ингаляций в контрольной группе и группе Мф и через 14 дней в группе ЦсА, а оценка клинического индекса у пациентов контрольной группы и группы Мф через 3 месяца, в группе ЦсА - через 1 месяц после окончания курса ингаляций.

Общеклинические методы исследования включали в себя: развернутый анализ крови, биохимический анализ крови, общий анализ мочи.

Функциональные методы исследования.

Компьютерная спирометрия с анализ кривой «поток-объем» проводился по стандартной методике на аппарате «SuperSpiro» (MicroMedical, Великобритания), получаемые результаты выражались в процентах к должной величине. Оценивались показатели: FVC, FEV1, PEF, MEF75, MEF50 и MEF25. Пикфлуометром (MicroMedical, Великобритания) пациенты 2 раза в день фиксировали пиковую скорость потока на выдохе.

Специальные лабораторные методы исследования: фенотипирование лимфоцитов периферической крови, исследование функциональной активности фагоцитов периферической крови, определение цитокинового статуса в периферической крови и жидкости бронхиального смыва.

Инструментальные методы исследования включали в себя:

Рентгенологическое обследование заключалось в выполнении рентгенографии органов грудной клетки по общепринятой методике.

Фибробронхоскопию выполняли под местной анестезией фибробронхоскопом BF-30 фирмы «Olympus», Япония трансназально в лежачем положении больного. Помимо атропинизации проводилась дополнительная премедикация β-агонистами и ГКС. При дыхательной недостаточности проводилась кислородотерапия. Производился бронхо-альвеолярный лаваж (БАЛ) и биопсия слизистой оболочки бронхов. Учитывая, что состояние пациентов не соответствовало международным критериям отбора больных для проведения БАЛ (ERS, 1990), то для получения жидкости БАЛ применялась не стандартная, а щадящая методика, заключающаяся в инстилляции 10 мл физиологического раствора в бронхиальное дерево с последующей аспирацией бронхиального содержимого. До лечения щипцевая биоспия выполнялась из шпоры VIII бронха, а после лечения – из шпоры VI бронха.

Для характеристики эндоскопической картины воспалительных изменений бронхов была использована классификация Г.И.Лукомского и соавт. (1982). Для математической обработки результатов эндоскопического исследования применялась качественно-количественная оценка воспалительных изменений бронхиального дерева (Нечаев В.И. 1980). Учитывались: гиперемия, отек, количество секрета, его вязкость и характер. Оценка проводилась по 4-х балльной шкале, при этом отсутствие патологических изменений принималось за 0 баллов, а максимальная выраженность признака – за 3 балла.

После получения материала при ФБС для гисто-ультраструктурного исследования бронхобиоптаты обрабатывались по стандартной методике с заливкой в аралдит. Полутонкие срезы толщиной 1-2 мкм окрашивали гематоксилином и эозином и толуидиновым синим и просматривали в электронном микроскопе JEM-100 C-X (Japan) при ускоряющем напряжении 80 кв.

Иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови проводилось методом проточной цитофлуорометрии. Процент антигенположительных клеток, экспрессирующих дифференцировочные антигены (CD3,CD4,CD8,CD16,CD20,CD25,CD95), определяли в «гейте» лимфоцитов на проточном цитофлуориметре «FACScan» (Becton Dickinson, США) с использованием ФИТЦ (флюоресцеин-5-изотиоцианат) меченых моноклональных антител производства НПЦ «Медбиоспектр». В каждом образце накапливали не менее 10000 событий. Анализ проводился с использованием программного обеспечения Consort 32 “Lysys II” версии 1.02 (3).

Функциональная активность нейтрофилов оценивалась по их способности поглощать частицы латекса, как в базальных, так и в стимулированных условиях. Определяли фагоцитарную активность, фагоцитарный индекс и резервную возможность фагоцитоза при стимуляции зимозаном. НСТ – тест. Принцип НСТ-теста, косвенно отражающего переваривающую способность фагоцитов, основан на восстановлении поглощенного растворимого нитросинего тетразолия (НСТ) в нерастворимый диформазан продуктами окислительно-восстановительных реакций. Подсчет проводили на 100 нейтрофилах. Определяли процент НСТ+ клеток и индекс стимуляции.

Иммуноферментное исследование цитокинового спектра крови и жидкости БАЛ проводили с помощью иммуноферментных тест-систем производства «Протеиновый контур» и «Цитокин» (Россия) на ридере Anthos 2020 (Австрия). В ходе работы исследованы концентрации ИЛ-4, ИЛ-5, sIL-2R, ИФН- и ФНО- в сыворотке крови и концентрации ИЛ-5, ИЛ-8, ИФН- и ФНО- в жидкости БАЛ.

Экспериментальное исследование влияния ультра-низких концентраций Мелфалана на биохимические показатели крови in vitro.

На базе НИИ педиатрии Научного центра здоровья детей РАМН (д.м.н. Е.М.Васильева) исследовалось влияние Мф на эритроциты 10 здоровых добровольцев in vitro, средний возраст 46±3,4 года. В пробу №1 добавляли физиологический раствор (контроль). Сравнивалось воздействие на эритроциты различных концентраций Мф (1,0 мкг/мл – проба №2 и 0,1 мкг/мл –проба №3), меньшая из которых соответствовала расчетной концентрации препарата в бронхиальном секрете пациентов при ингаляциях in vivo.

Во всех образцах проводилось исследование: активности общей активируемая аденозинтрофосфатаза (АТФазы); Ca,Mg- АТФазы; Na/K-АТФазы, активности супероксиддисмутазы (СОД); интенсивности процессов перекисного окисления по уровню общего, связанного и свободного малонового диальдегида (МДА) и механического и перекисного гемолиза эритроцитов, проценту прироста гемолиза эритроцитов; уровня внутриклеточных свободных катионов: железа, магния, меди, цинка и фосфат аниона.

Об активности Ca, Mg- и Na/K-АТФаз судили по приросту неорганического фосфата в течение 60-минутной инкубации в среде, содержащей 3 mM MgCl2 , 120 mM NaCl, 20 mM KCl, 3 mM АТФ, 10 mM HЕPES (рН 7,4). Без уабаина определялась общая АТФазная активность, а в присутствии 3 mM уабаина – активность Ca,Mg-АТФазы. По разности судили об активности Na,K-АТФазы.

Содержание фосфора в среде определяли спектрофотометрически по методу Лоури-Лопеца в модификации Скулачева.

Активность СОД исследовалась с помощью стандартных наборов фирмы Randox на спектрофотометре DU530 (Beckman Coulter, США).

Перекисные процессы изучались скрининг-методом определения интенсивности метаболических процессов в мембране эритроцита в соответствии с ранее описанной методикой. При этом исследовались: механический и перекисный гемолиз эритроцитов, процент прироста гемолиза эритроцитов, уровень общего, связанного и свободного МДА.

Содержание катионов и фосфата определяли на автоматическом анализаторе Synchron CX 5Δ, (Beckman Coulter, США).

Статистическая обработка результатов

Для описательной статистики массивов данных, подвергающихся нормальному распределению, применялось М±м. Для описания непараметрических данных использовалась медиана и 25 и 75 персентили. Статистическая обработка данных проводилась с использованием параметрических - Т-критерий Стьюдента, коэффициент корреляции Пирсона и непараметрических - критерий Уилкоксона и коэффициент корреляции Спирмена методов. Различия считались достоверными при p<0,05.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1.1 Исследование эффективности лечения пациентов с БА ингаляциями ультра-низких доз Мф.

Клиническое состояние больных группы Мф и контроля до и через 3 месяца после лечения представлены в Таблице 3.

На основании приведенных данных можно сделать вывод, что у пациентов контрольной группы через три месяца после проведенной терапии наблюдается тенденция к снижению частоты и тяжести приступов и значимое снижение частоты использования b₂-агонистов - с 1,90,3 до 1,3±0,4 (р<0,05), что свидетельствует о положительном клиническом эффекте проводимой стандартной терапии.

Таблица 3.

Динамика клинических показателей у больных до и после лечения

		Группа Мф		Группа контроля
Показатель		До лечения	Через 3 мес.	До лечения	Через 3 мес.
Одышка		1,70,2	1,3±0,2**	1,80,2	1,6±0,4
Кашель		1,50,2	1,2±0,1	1,50,2	1,2±0,3
Наруш. толер. к физ. нагр.		2,10,2	1,1±0,1**	2,00,3	1,7±0,3
Частота исп. b₂-агонистов		1,80,2	1,4±0,2*	1,90,3	1,3±0,4*
Приступы	частота	2,3±0,1	1,4±0,4*	2,20,1	1,7±0,3
Приступы	тяжесть	1,9±0,2	0,8±0,1**	2,20,1	1,4±0,4
Клинический индекс		1,90,1	1,2±0,1*	2,00,1	1,7±0,3

Blog

Таблица 3.

Динамика клинических показателей у больных до и после лечения

Одышка