Получение и использование моноклональных антител в диагностике гриппа птиц 16. 00. 03 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Вид материала

Автореферат

Содержание Производственные испытания «Набора для иммуноферментной диагностики гриппа птиц на основе моноклональных антител» Н5N1 (антиген №3), и коммерческом антигене Н5N1 Mab/INF – 1А9 Mab/INF – 1А9 А штамма H5N1 Практические предложения Список опубликованных работ Ақанова Жаннара Жульдасқызы Жұмыстың мақсаты Жұмыстың ғылыми жаңалығы Зерттеу нәтижелері Зерттеу нәтижелерін қолданысқа енгізу The following tasks were provided to achieve this goal The main provisions for the defense The results of the study The implementation of the research results Field of application

Подобный материал:

• Иммунный статус поросят при пневмонии, вызванной вирусом репродуктивно-респираторного, 398.05kb.
• Функциональная и рецепторная характеристика белков суперсемейства иммуноглобулинов, 1127.13kb.
• Эпизоотологический мониторинг и иммунопрофилактика классической чумы свиней и болезни, 755.76kb.
• Совершенствование системы ветеринарно-профилактических мероприятий и её влияние, 471.82kb.
• Темы рефератов для поступления в аспирантуру по научной специальности 06. 02. 02 ветеринарная, 14.27kb.
• Кудряшова жанна Алексеевна Теоретические и практические аспекты новых подходов профилактики, 392.23kb.
• Оптимизация системы контроля эпизоотического процесса некробактериоза крупного рогатого, 1086.61kb.
• Программа вступительного экзамена в аспирантуру по специальной дисциплине 06. 02., 270.79kb.
• Терапевтическая эффективность гинодиксина при эндометритах и маститах у коров, вызванных, 301.79kb.
• Резервуары лиссавирусов на территориях, стационарно неблагополучных по бешенству 16., 223.09kb.

Производственные испытания «Набора для иммуноферментной диагностики гриппа птиц на основе моноклональных антител»

Все реагенты разработанной тест-системы для серологической диагностики гриппа птиц для удобства исследователя скомпонованы в наборы, которые содержат все необходимое для проведения исследований проб сывороток крови вне лаборатории.

Для проведения производственных испытаний «Набора для иммуноферментной диагностики гриппа птиц на основе моноклональных антител», разработанной в НИИ биотехнологии АО «Казахский агротехнический университет им. С. Сейфуллина» проведено исследование 169 сывороток крови кур отобранных в АО «Акмола-Феникс», и 100 проб из ТОО «Агрофирма Курма» Карагандинской области.

На базе Республиканской ветеринарной лаборатории г. Астаны в отделе «Диагностика заболеваний животных» и на базе Карагандинского областного филиала РГП «РВЛ» КГИ в АПК МСХ РК была проведена подготовка и исследование 169 проб и 100 проб соответственно, с использованием разработанной нами тест-системы и коммерческих тест-систем. В качестве положительных проб использовали сыворотки крови птиц отобранных в 2005 году от положительно реагировавших птиц в очаге вспышки гриппа птиц (Северо-Казахстанская область с. Дубровное) и коммерческие положительные сыворотки H5N1 (производство Италия).

Результаты исследования 269 проб сывороток крови кур оказались отрицательными во всех использованных тестах (иммунохроматография, ПЦР, тест-система диагностическая иммуноферментная для выявления антител вируса гриппа птиц конкурентным методом (Франция)). Данные предлагаемого нами иммуноферментного теста, полученные в сравнении с другими методами исследований, показали высокую идентичность, что объясняется присутствием на твердой фазе «захватывающих МКА», благодаря неизменным свойствам, которых и обеспечивается исключительная специфичность.

Испытание разработанного варианта ИФА в сравнении с другими методами исследований показали возможность использования данного теста в ветеринарной практике. Использование в качестве носителя нитроцеллюлозной мембраны не требует наличия специальной аппаратуры и позволяет проводить анализ сывороток крови птиц в полевых условиях.

Таким образом, в лабораторных и производственных условиях показана возможность эффективного использования изготовленной иммуноферментной тест-системы на основе моноклональных антител для обнаружения специфических антител к антигену ВГП в сыворотке крови птиц.


ВЫВОДЫ

На основании проведенных исследований можно сделать следующие выводы:

1. 
   В аллантоисной жидкости куриных эмбрионов, зараженных вирусом полевого штамма Н5N1 (антиген №3), и коммерческом антигене Н5N1 (антиген №2) содержаться белки с молекулярной массой 36 кД, 66 кД, 70 кД; белковые фракции с молекулярной массой 24 кД, 29 кД, 69 кД обнаруживаются в препаратах из вакцины (антиген №1), аллантоисной жидкости и в коммерческом антигене соответственно.
   
2. Антиген №2 проявляет наиболее высокую серологическую активность
   

по отношению к положительным сывороткам в реакции иммунодиффузии (1:32) и иммуноферментном анализе (1:204800) по сравнению с антигеном №3 (1:32 и 1:51200) и №1 (1:8 и 1:25600).

3. Получен штамм гибридных культивируемых клеток мышей, иммунизированных антигеном №2 (авторское название Mab/INF – 1А9), продуцирующий моноклональные антитела к антигену вируса гриппа птиц с молекулярной массой 36 кД.
   
4. Моноклональные антитела, синтезируемые гибридомой штамма Mab/INF – 1А9 относятся к иммуноглобулинам класса G подкласса G3, а так же имеют высокую константу связывания (1х10⁹М), что позволяют использовать их в иммуноферментном анализе.
   
5. Моноклональные антитела в ИФА взаимодействуют с эпитопами антигена вируса гриппа птиц типа А штамма H5N1, не вступая в перекрестную реакцию с вирусами гриппа птиц других серогрупп, что свидетельствует о возможности их использования для типизации патогена.
   
6. Иммуноферментная тест-система на основе моноклональных антител, продуцируемых штаммом гибридных культивируемых клеток Mab/INF – 1А9, обладает высокой чувствительностью и специфичностью при серологической диагностики высокопатогенного гриппа птиц.
   

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Штамм гибридных культивируемых клеток животных – продуцент МКА Mus Мusculus L. (авторское название Mab/INF – 1А9), депонированный в ДГП «Республиканская коллекция микроорганизмов» (г.Астана) (регистрационный номер С–RKM–0279) предлагается в качестве источника специфических антител к антигенам вируса гриппа птиц типа А штамма H5N1.
   
2. Методические рекомендации по применению иммуноферментного анализа на основе МКА в серологической диагностике высокопатогенного гриппа птиц предлагаются для специалистов ветеринарных лабораторий, научно-исследовательских учреждений и студентов факультета ветеринарной медицины.
   
3. Результаты НИР внедрены в программу дисциплин при подготовке бакалавриата и магистратуры по специальности 050701 - Биотехнология, 051201 - Ветеринарная медицина.
   

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. 
   Куйбагаров М. А. Аканова Ж.Ж. Способ выделения антигенов возбудителя гриппа птиц и изучение их свойств.// Тезисы докладов республиканской научно- теоретической конференции «Сейфуллинские чтения- 3», посвященной 50-летию основания КазГАТУ Астана 2007. –С. 96-97.
   
2. Боровиков С.Н., Куйбагаров М.А., Аканова Ж.Ж. Получение и культивирование гибридом, синтезирующих моноклональные антитела к антигену вируса гриппа птиц типа А штамма H5N1.// Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 50-летию основания АО «Казахского агротехнического университета им. С. Сейфуллина», Астана 2007. – С. 133-134.
   
3. Боровиков С.Н., Куйбагаров М.А., Аканова Ж.Ж. Выделение и изучение свойств белкового антигена из инактивированной эмульгированной вакцины против гриппа птиц штамма H5N1.// Материалы республиканской научно-теоретической конференции «Сейфуллинские чтения-4», Астана 2008. – С. 91-92
   
4. Borovikov S. N., Bulashev A. K., Kuibagarov M. A., Suranshiev Zh. A., Akаnova Zh.Zh., Ibraev N. E. Hybridoma receipt synthesizing monoclonal antibodies to avian flu virus antigens and studying their properties//Science Review S. Seifullin Kazakh Agro Technical University. Volume 1(2) P 3-10
   
5. Куйбагаров М.А., Ибраев Н.Е., Аканова Ж.Ж., Клюков М.В. Определение оптимальной схемы иммунизации антигенами вируса гриппа птиц.// Материалы республиканской научно-теоретической конференции «Сейфуллинские чтения – 5. Т. 1. Астана. 2009. – С. 57-58.
   
6. Булашев А.К., Боровиков С.Н., Куйбагаров М.А., Аканова Ж.Ж., Ибраев Н.Е. Активность гибридом синтезируемых моноклональные антитела к вирусу гриппа типа а штамма Н5N1, в зависимости от иммунизации линейных мышей.// Вестник науки «Казахского агротехнического университета им. С. Сейфуллина», №4/(55) Астана 2009. – С. 169-173.
   
7. Боровиков С.Н., Аканова Ж.Ж. Точечный вариант иммуноферментного анализа для диагностики гриппа птиц//Вестник наук «Казахского агротехнического университета им. С. Сейфуллина», №1/(56) Астана 2010. С. 107 – 110.
   
8. Аканова Ж.Ж. Получение и очистка антигена вируса гриппа птиц.// Вестник Семипалатинского государственного университета им. Шакарима № 1 (49) Астана 2010. С. 185 – 188.
   
9. Аканова Ж.Ж., Боровиков С.Н., Булашев А.К., Куйбагаров М.А. Методические рекомендации по применению тест-системы ИФА на основе моноклональных антител для серологической диагностики высокопатогенного гриппа птиц //Астана, 2010. -20с.
   

Ақанова Жаннара Жульдасқызы


Моноклоналды антиденелерді алу және оларды құс тұмауын балауда қолдану


Мал дәрігерілік ғылымдарының кандидаты ғылыми дәрежесін іздену үшін дайындаған диссертациясының авторефераты


16.00.03 – мал дәрігерлік микробиология, вирусология, эпизоотология, микология микотоксикологиямен бірге және иммунология


ТҮЙІН

Зерттеу нысаны: құс тұмауы вирусының А типі H5N1 штамының антигендері, ВАLB/с тышқандарының иммунды В-лимфоциттері, Х63 Ag 8.6.5.3. миелома жасушалары, құс тұмауы вирусының А типі H5N1 штамының антигендеріне телімді моноклоналды антиденелер, ИФТ әдісімен құс тұмауы вирусының антигенін қан сарысуынан анықтауға арналған тест – жүйесінің компоненттері.

Жұмыстың мақсаты: құс тұмауы вирусының А типі H5N1 штамының антигендеріне телімді моноклоналды антиденелер алып, олардың негізінде құстардың қан сарысуынан антиденелерді анықтауға арналған иммунды ферменттік талдаудың қойылымын әзірлеу.

Осы мақсатқа жету үшін келесі міндеттер қойылды:

1. Құс тұмауы вирусының антигендерін алу және тазарту әдісін оңтайландыру.

2. Құс тұмауы вирусының диагностикалық маңызды антигендеріне қарсы моноклоналды антиденелерді алу және олардың препаративті мөлшерін in vitro және in vivo әдісімен жинау.

3. Алынған моноклоналды антиденелердің негізгі иммунохимиялық қасиеттеріне сипаттама беру.

4. Құстардың қан сарысуынан телімді антиденелерді анықтауға арналған иммунды ферменттік талдаудың түрлі қойылымдарында моноклоналды антиденелерді қолданудың тиімді жағдайларын әзірлеу.

5. Құс тұмауын серологиялық балауға арналған моноклоналды антиденелердің негізіндегі иммунды ферменттік талдау қойылымының диагностикалық маңызын анықтау.

Жұмыстың ғылыми жаңалығы

Алғаш рет құс тұмауы вирусының А типі H5N1 штамының белокты антигеніне телімді моноклоналды антиденелерді өндіретін гибридті жасушалар штамы алынды.

Моноклоналды антиденелердің негізгі сипаттамалары және иммунды ферменттік талдауда қолдану жолдары анықталды.

Қ


ұс тұмауын серологиялық балау үшін моноклоналды антиденелердің негізіндегі отандық иммунды ферменттік тест-жүйесінің компоненттері әзірленді.

Қорғауға шығарылған негізгі қағидалар:

1. Құс тұмауы вирусының H5N1 штамының белокты антигенін алу технологиясы.

2. Құс тұмауы вирусының А типі H5N1 штамының антигеніне телімді моноклоналды антиденелерді өндіретін гибридті жасушалар штамының сипаттамасы; моноклоналды антиденелердің иммунохимиялық және иммунобиологиялық қасиеттері.

3. Құс тұмауын серологиялық балау үшін моноклоналды антиденелердің негізіндегі иммунды ферменттік тест-жүйесі.

Зерттеу әдістері:

Антигендерді алу және тазарту үшін спиртті прицепитация және сахароза градиентінде ультроцентрифугалау әдісі қолданылды.

Иммунды тышқандардың спленоциттері мен Х63Ag8.6.5.3. миелома жасушаларын будандастыру V.Oi, L. Herzenberg (1980) әдісімен жүргізілді.

Моноклоналды антиденелердің электрофорезі V.K. Laemmli (1970) әдісімен жүргізілді, гибридті жасушалар J. Goding et. al. (1983) тәсілімен клондалды. Моноклоналды антиденелердің константтық байланысы J.Beatty et al. (1987) әдісімен анықталды. Моноклоналды антиденелердің класын диффузиялық преципитация реакциясында O.Ouchterlony (1958) әдісімен айқындадық. Антигендерді гельден нитроцеллюлозалы мембранаға электрофорездік ауыстыру H.Towbin et al. (1989) әдісімен иммуноблотингке арналған аспапта жүзеге асырылды. Моноклоналды антиденелердің иммунологиялық қасиеттерін зерттеу иммунды ферменттік талдаудың түрлі тәсілдерімен жүргізілді.

Зерттеу нәтижелері

Спиртті прицепитация және сахароза градиентінде ультроцентрифугалау әдісімен антигеннің препаративті мөлшері алынды, сондай–ақ H5N1 штамының коммерциялық антигені қолданылды.

1:12800–1:25600 титрдегі антиденелерді алуға мүмкіндік беретін BALB/c тышқандарын иммундеу тәсілі оңтайландырылды. Зерттеу нәтижесінде құс тұмауы вирусының үш антигеніне бағытталған моноклоналды антиденелер алынды.

Гибридомдық техника әдісімен гибридті жасушалар штамы алынды: 1А9. Гибридомалар құс тұмауы вирусының H5N1 штамының антигеніне телімді моноклоналды антиденелерді тұрақты өндіреді: in vitro 0,05 мг/мл, in vivo 8 мг/мл.

1А9 гибридома түзетін антиденелер IgG₃ субклассына жатады. Моноклоналды антиденелердің байланысу константасы - 1x10^-9M мөлшерінде сипатталды.

М


оноклоналды антиденелердің телімділігі мен сезімталдылығын зерттеу нәтижесінде, құс тұмауы вирусының қоздырғышына қарсы түзілген қан сарысуындағы антиденелерді анықтауға арналған тиімді балау препараттарын әзірлеуде қолдануға болатындығына көз жеткізілді.

Құс тұмауы вирусының антигеніне қарсы түзілген антиденелерді анықтауға арналған моноклоналды антиденелердің негізіндегі иммунды ферменттік талдаудың нүктелі сэнвич әдісінің тиімді қойылымы әзірленді.

Зерттеу нәтижелерін қолданысқа енгізу:

Авторлық атауы Mab/INF-1А9 (регистрациялық номері C-RKM-0279) құс тұмауы вирусының H5N1 штамының белокты антигеніне телімді моноклоналды антиденелерді өндіреді гибридті жасушалар штамы «Қазақстан Республикасының Ұлттық биотехнология орталығына қарасты «Республикалық микроорганизмдер коллекциясына» сақтауға тапсырылды (Астана қ.) және құс тұмауын балау әдістерін әзірлеуде қолдануға ұсынылады.

Моноклоналды антиденелер негізінде әзірленген иммунды ферменттік тест жүйе компоненттері әзірленіп, оларды ғылыми-зерттеу және ветеринарлық зертханаларда құс тұмауын балау үшін қолдануға ұсынылады.

Диссертациялық жұмыстың негізгі нәтижелері С.Сейфуллин атындағы Қазақ агротехникалық университетінде бакалавриат мамандықтары бойынша «Микробиология және вирусология», «Иммунология негіздері», «Жасушалық биотехнология» пәндері бойынша зертханалық-тәжірибелік сабақтар материалдарына енгізілді.

Қолдану аймағы: ветеринария және биотехнология.


Zhannara Zh. Akanova

The receipt and the use of monoclonal antibodies in the diagnosis of avian influenza

The dissertation on competition of a scientific degree of the candidate
of veterinary sciences

16.00.03-veterinary microbiology, virology, epizootology, mycology with mycotoxicology and immunology

Summary

The object of the research: Avian influenza virus type A strain H5N1 antigens, immune B cells of laboratory mice of the BALB/с, myeloma cell line X 63.Ag.8.6.5.3, monoclonal antibodies specific to antigens of avian influenza virus H5N1 , the components of a test system for detection of antibodies in the serum to the antigen of avian influenza virus by ELISA.

The purpose is to obtain the monoclonal antibodies to antigens of avian influenza type A strain H5N1, as elaboration of the ELISA for detecting antibodies in the serum of birds and test them in laboratory conditions.

The following tasks were provided to achieve this goal:

1 Develop the scheme of obtaining and purification of antigen AIV;
2 Production of monoclonal antibodies to diagnostically useful antigens of avian influenza virus and working out of their preparative dose by in vitro and vivo methods.

3 Determination of basic immunochemical properties of monoclonal antibodies.
4 Testing of optimal conditions of use of monoclonal antibodies in a variety of ELISA for detection of the specific antibodies in the serum of birds.
5 Value are developed ELISA method based on monoclonal antibodies for serological diagnosis of avian influenza as diagnosticum.

The scientific novelty of the research results Hybrid strain cultured cells the producer of monoclonal antibodies to protein antigens of avian influenza type A strain H5N1 was obtained for the first time. The basic characteristics of the monoclonal antibodies and parameters for its application in ELISA were studied. The components of domestic enzyme immunoassay system based on monoclonal antibodies for serological diagnosis of avian influenza were developed.

The main provisions for the defense:

1 The technology for producing the protein antigen of avian influenza virus H5N1 strain and its immunochemical characterization.

2 Characteristics of strains hybrid cells producing monoclonal antibodies to the antigen of AIV type A strain of H5N1; immunochemical and immunobiological properties of monoclonal antibodies.

3


Enzyme linked immunoassay system based on monoclonal antibodies for serological diagnosis of AIV type A strain of H5N1.

Methods: For the production and purification of antigens alcohol precipitation and ultracentrifugation in sucrose gradient was used. By the V. Oi, L. Herzenberg, method (1980) the hybridization of myeloma cells H63Ag8.6.5.3. and immune splenocytes were carried out by the V. Oi, L. Herzenberg method 1980. Study of monoclonal antibodies drugs was performed by electrophoresis VK Laemmli et al. (1970), the hybrid clones cloned by J. Goding et al. (1983) binding constants of monoclonal antibodies was determined by the method of J. Beatty et al. (1987). Class and subclass antibodies were determined by double immunodiffusion by the method of O. Ouchterlony (1958). Electrophoresis transfer of antigens from the gel onto a nitrocellulose membrane was carried out by using the device for immunoblotting of H. Towbin et al. (1989). Imm properties had been studied by using diff variants of ELISA.

The results of the study: By the method of alcohol precipitation and ultracentrifugation in sucrose gradient preparative amounts of antigen were obtained, as well as using of commercial strain H5N1 antigen.

Pattern of immunization mice BALB/c, allowing us to obtain serum antibody titre 1:12800-1:25600 was worked out. Mab medication directed against three antigens of avian influenza virus was obtained in the result of the research. By hybridoma technology method the hybrid strain cultured cells was obtained: 1A9. Hybridomas stably produce monoclonal antibodies to antigens of avian influenza virus-specific strain of H5N1: in vitro 0,05 mg/ml, in vivo 8 mg/ml. Synthesized by hybridoma 1A9 antibody belongs to the subclass IgG3. Binding constant of the - 1x10^-9M.

The results of the study of specificity and immunochemical characteristics of suggest the possibility of their use in the development of effective diagnostic products for the detection of antibodies in the serum of pathogen avian influenza virus. The best option staging point sandwich ELISA based on monoclonal antibodies for the detection of antibodies to antigens of avian influenza virus was worked out.

The implementation of the research results: Hybrid cultured cells strait the producer of monoclonal antibodies to protein antigens of AIV H5N1 strain name a Mab/INF-1A9 (registration number C-RKM-0279) deposited in "Republican Collection of Microorganisms (Astana) and proposed for the use of influenza diagnosis methods developing.

Components of enzyme immunoassay system based on monoclonal antibodies which is proposed to be used for the research and veterinary laboratories to diagnose avian influenza were developed.

Proceedings of the thesis in the learning process during the laboratory practical lessons on discipline "Cells Biotechnology" were introduced, "Fundamental Immunology", "Microbiology and Virology" for undergraduate majors of Kazakh Agro Technical University named by S.Seifullin.

Field of application: veterinary medicine and biotechnology.

Сдано в набор 10.11.2010 г.		Подписано в печать 11 .11.2010 г.
Формат 60х84 1\16		Заказ № 8725
Усл.печ.л. 1,5		Тираж 100 экз.

© Издательство АО Казахского агротехнического университета им. С.Сейфуллина

010011, г. Астана, пр. Победы, 62а.