Выделение и идентификация нетуберкулезных микобактерий у пациентов фтизиатрических учреждений 03. 00. 07 Микробиология
| Вид материала | Автореферат |
- Бактериологическая диагностика туберкулеза внелегочных локализаций с исследованием, 271.98kb.
- Идентификация и внутривидовое типирование возбудителей сапа и мелиоидоза 03. 00., 750.11kb.
- Омелотерапия в онкологии с точки зрения доказательной медицины, 135.77kb.
- Цивилизации древнего востока, 288.82kb.
- Примерная программа дисциплины микробиология, вирусология, микробиология полости рта, 447.35kb.
- «Микробиология», 161.59kb.
- Контрольная работа по дисциплине Микробиология По теме Общая и специальная микробиология, 208.97kb.
- Резолюция второго всероссийского конгресса пациентов город Самара 03 ноября 2011, 206.55kb.
- Вопросы к экзамену по дисциплине «Микробиология, физиология питания, санитария», 45.83kb.
- Рабочей программы учебной дисциплины (модуля) микробиология, 48.16kb.
На правах рукописи
Макарова Марина Витальевна
ВЫДЕЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ НЕТУБЕРКУЛЕЗНЫХ МИКОБАКТЕРИЙ У ПАЦИЕНТОВ ФТИЗИАТРИЧЕСКИХ
УЧРЕЖДЕНИЙ
03.00. 07 – Микробиология
Автореферат
Диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Москва – 2010
Работа выполнена в Московском городском научно-практическом центре борьбы с туберкулезом Департамента здравоохранения города Москвы
Научные консультанты:
Доктор медицинских наук, профессор Мороз Аркадий Максович
Доктор медицинских наук, профессор Сельцовский Петр Петрович
Официальные оппоненты:
Доктор медицинских наук, профессор Батуро Алла Петровна
Доктор медицинских наук, профессор Леви Диана Тимофеевна
Доктор биологических наук, профессор Шемякин Игорь Георгиевич
Ведущая организация: Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза Российской академии медицинских наук (ЦНИИТ РАМН), Москва.
Защита состоится 15 апреля 2010г. в 1200 часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН (105064 Москва, Малый Казенный пер., д. 5а).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН (105064 Москва, Малый Казенный пер., д. 5а).
Автореферат разослан «______» «_________________» 2010 г.
Ученый секретарь диссертационного совета
кандидат биологических наук И.В.Яковлева
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Нетуберкулезные микобактерии – это микроорганизмы, про которые в начале второй половины ХХ века хорошо знали микробиологи, а в некоторых странах и клиницисты (вызываемую ими патологию называют микобактериозами). Но затем эта проблема была в значительной степени забыта и вновь приобрела актуальность с распространением ВИЧ-инфекции, поскольку у ВИЧ-инфицированных (особенно на стадии СПИД) часто развиваются микобактериозы, которые в большом числе случаев приводят к летальному исходу [Katoch V., 2004; Khatter S., 2008].
В настоящее время род Mycobacterium включает более 100 видов, и их число продолжает увеличиваться [Euzeby J., 2002; Katoch V., 2004]. Из них наиболее распространены M. tuberculosis и M. leprae, вызывающие у людей хорошо известные заболевания. Несколько видов микобактерий входят в так называемый M. tuberculosis complex: M. tuberculosis, М. bovis, M. africanum, M. microti, M. canetti, M. caprae, M. pinnipedii. Остальные широко распространены в окружающей среде как сапрофиты, однако в некоторых случаях они могут быть этиологическими факторами тяжелой (вплоть до смертельной) патологии, чаще у людей, имеющих нарушения иммунитета различной природы [Модель Л.М., 1958; Зыков М.П., 1984; Лазовская А.Л., 1991; Оттен Т.Ф., 1994, 1999; Новожилова И.А., 2004; Wolinsky E., 1979, 1992; Tells C., Putnam J., 1980; Grange J., Yaters M., 1986; Wallace R. et al., 1990, 1997; Olivier K., 1998; Dawson D., 2000; Euzeby J., 2003; Heifets L., 2004; Jarzembowski J., Yong M., 2008].
Не входящие в M. tuberculosis complex микобактерии долгие годы называли микобактериями окружающей среды (enviromental mycobacteria), возбудителями микобактериозов, атипичными микобактериями. Однако, в последние десятилетия большинство микробиологов использует термин «нетуберкулезные микобактерии» (НТМ) [Wallace R. et al., 1990, 1997; Dawson D., 2000; Katoch V., Kumar М., 2001; Heifets L., 2004].
Значительный вклад в изучение нетуберкулезных микобактерий и вызываемой ими патологии внесли отечественные исследователи, работавшие в 50-70 годы XX века: Л.М. Модель, М.М. Дыхно, Н.М. Макаревич, Н.М. Рудой, Я.А. Благодарный, Т.Б.Яблокова, Т.Б. Ильина, Р.О.Драбкина, Ю.К. Вейсфейлер и др. Затем, в течение многих лет исследования в этой области продолжались в небольшом объеме лишь в некоторых регионах России, в первую очередь, в Санкт-Петербурге [Оттен Т.Ф., Васильев А.В., 2005].
За это время ситуация в мире резко изменилась, число больных микобактериозами во многих странах возросло в десятки раз. Это явилось следствием увеличения числа лиц с серьезными нарушениями иммунитета (в первую очередь ВИЧ-инфицированных) [Marras T., Daley C.,2002; Cole T. et al.,2005], а также применения новых чувствительных и специфичных методов выделения и идентификации микобактерий (культивирование в автоматизированных системах с использованием жидких питательных сред, молекулярно-генетические методы и высокоэффективная жидкостная хроматография – ВЭЖХ), которые позволили существенно ускорить диагностику микобактериозов и повысить ее эффективность [Butler W., Guthertz L., 2001; Fukushima M. et al., 2003; Shin J. et al., 2009].
Заболевания, вызываемые разными видами НТМ, характеризуются сходной с туберкулезом клинико-рентгенологической картиной, но требуют применения схем лечения, отличных от химиотерапии туберкулеза, из-за высокой их резистентности к противотуберкулезным препаратам [Cole T.et al., 2005]. Перед микобактериологическими лабораториями стоят важные задачи по раннему выявлению и идентификации микобактерий туберкулезного комплекса (МБТ) и нетуберкулезных микобактерий. Это необходимо для своевременного проведения мероприятий по предотвращению распространения инфекции и назначения адекватной терапии.
В зарубежной литературе по данной проблеме в последние годы опубликовано много работ, исследования по изучению НТМ и микобактериозов прогрессируют стремительно [Wallace R. et al., 1990, 1997; Katoch V., 2004; Heifets L., 2004; Jarzembowski J., Yong M., 2008].
К сожалению, в нашей стране понимание того, насколько важна эта проблема, еще не достигнуто, в абсолютном большинстве регионов отсутствуют также методические возможности, которые позволили бы реально идентифицировать вид нетуберкулезных микобактерий, установить диагноз микобактериоза и назначить своевременное лечение.
Кроме того в России микобактериозы не считаются самостоятельными заболеваниями, несмотря на то, что они включены в Международную классификацию болезней. В связи с такой ситуацией, врачи не знают особенностей течения и лечения этой патологии, нет специальных курсов обучения, не используются современные методы диагностики микобактериозов. Сегодня даже не ясно, в каких учреждениях следует лечить таких больных. Часто пациенты, страдающие микобактериозами, находятся в одних палатах с больными туберкулезом и могут инфицироваться от них, а возможно и заражать их.
Все вышеизложенное определяет актуальность и необходимость разработки комплекса методов выделения и идентификации НТМ с применением всех имеющихся в настоящее время технических возможностей.
Цель исследования
Создание оптимального комплекса выделения и идентификации нетуберкулезных микобактерий (НТМ) с использованием разработанных и модифицированных методов и на этой основе изучение видового состава выделенных НТМ, включая оценку их чувствительности к антибактериальным препаратам.
Задачи исследования
- Изучить эффективность наиболее широко применяющихся в мировой практике питательных сред: плотной яичной Левенштейна-Йенсена, плотной агаровой Миддлбрука 7Н11 и модифицированной жидкой Миддлбрука 7Н9 (в автоматизированной системе BACTEC МGIT 960) для выделения НТМ.
2. Провести сравнительный анализ использования для видовой идентификации микобактерий методов высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), оценки полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) и микробиологических методов.
3. Разработать для видовой идентификации НТМ новый молекулярно-генетический метод – биологические микрочипы, сопоставить эффективность его использования с методами ПДРФ, ВЭЖХ и микробиологическими методами.
4. На основании результатов сравнительных исследований эффективности различных методов выделения и идентификации НТМ разработать оптимальный диагностический комплекс (алгоритм), с его применением охарактеризовать видовой спектр штаммов НТМ, циркулирующих в городе Москве.
5. Проанализировать частоту повторного обнаружения у больных одного и того же вида НТМ, как критерия (при наличии клинико-рентгенологических признаков заболевания) развития микобактериоза.
6. Выявить особенности чувствительности к противотуберкулезным и другим антибактериальным препаратам НТМ, выделенных из диагностического материала, поступившего в Централизованную микробиологическую лабораторию МНПЦБТ из противотуберкулезных учреждений города Москвы.
Научная новизна исследования
В результате сравнительного изучения эффективности выделения НТМ с помощью модифицированной жидкой питательной среды Миддлбрука 7Н9 (в автоматизированной системе BACTEC MGIT 960), агаровой Миддлбрука 7Н11 и яичной питательной среды Левенштейна-Йенсена установлено, что наибольшее число микобактерий из клинического материала удается выделить при использовании жидкой питательной среды Миддлбрука 7Н9. При этом срок детекции роста микобактерий в 1,9 раз короче, чем на плотной яичной и в 1,5 раза, чем на плотной агаровой среде. Поскольку на плотных питательных средах дополнительно удается получить до 10% изолятов, оптимальным для выделения НТМ является комплексное применение жидкой и одной из плотных (агаровой или яичной) питательных сред.
Выявлено (при субкультивировании на чашках с агаровой средой Миддлбрука 7Н11), что клинические изоляты, выделенные на жидкой и плотной яичной питательных средах, могут содержать несколько видов микобактерий.
Впервые для идентификации видов НТМ разработан метод биологических микрочипов: поэтапно испытаны несколько модификаций биочипов с последовательным увеличением количества иммобилизированных в лунках с гелем специфических олигонуклеотидов. В итоге полученный «БИОЧИП IMS» позволяет идентифицировать 9 видов НТМ: M. avium, M. intracellulare, M. sсrofulaceum, M. kansasii, M. gordonae, M. xenopi, M. marinum, M. fortuitum, M. chelonae и дифференцировать их от M. tuberculosis complex (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG).
В результате сравнительного изучения эффективности видовой идентификации микобактерий с помощью разработанных биочипов, методов ПДРФ и ВЭЖХ на большом объеме клинического материала показано, что все эти методы дают сопоставимые результаты с данными микробиологических исследований, не зависящие от того в жидкой или на плотных питательных средах выделены культуры микобактерий, но в значительно более короткие сроки. Дополнительным преимуществом биочипов является автоматизированный учет результатов с помощью программного обеспечения и возможность идентификации микобактерий непосредственно в клиническом материале.
Впервые разработан и обоснован оптимальный комплекс методов (алгоритм) выделения и идентификации НТМ, который включает: культивирование биологического материала на двух питательных средах – плотной и жидкой и идентификацию полученной культуры микобактерий методами ВЭЖХ и/или ПДРФ, либо биологических микрочипов (использование последнего – предпочтительнее).
Впервые с помощью разработанного алгоритма охарактеризован видовой состав НТМ, выделенных от больных туберкулезом и лиц с подозрением на туберкулез в городе Москве. С наибольшей частотой среди медленнорастущих НТМ из клинического материала выделяются МАС, M. xenopi и M. kansasii а быстрорастущих – M. fortuitum. Большинство клинических изолятов НТМ отличается высоким уровнем устойчивости как к основным, так и к большинству резервных противотуберкулезных препаратов и чувствительностью к таким фторхинолонам, как ципрофлоксацин и моксифлоксацин.
Впервые создана коллекция клинических изолятов (548 штаммов) нетуберкулезных микобактерий (относящихся к 14 видам), идентифицированных с помощью микробиологических, молекулярно-генетических методов и ВЭЖХ.
Практическая значимость работы и внедрение результатов в практику.
Предложено для эффективного выделения НТМ из биологического материала производить его посев на 2 питательные среды: жидкую Миддбрука 7Н9 (в автоматизированной системе BACTEC MGIT 960) и одну из плотных (агаровую или яичную). Субкультивирование на чашках с агаровой средой Миддлбрука 7Н11, выделенных на жидкой и плотной яичной (Левенштейна-Йенсена) питательных средах культур, позволяет обнаружить несколько видов микобактерий и изучить их культурально-морфологические свойства.
Высокая степень совпадения результатов идентификации микобактерий методом ВЭЖХ с данными микробиологических исследований, а также возможность идентификации большего числа видов, по сравнению с традиционными микробиологическими методами, определяет целесообразность применения этого метода в бактериологических референс-лабораториях. Важное практическое значение имеет сокращение времени такого исследования до 24-х часов, вместо 3-4-х недель при использовании микробиологических методов.
Результаты видовой идентификации культур нетуберкулезных микобактерий с помощью молекулярно-генетических методов – ПДРФ и биологических микрочипов аналогичным образом в большинстве случаев совпадают с данными микробиологических исследований при существенном сокращении времени получения результатов. В связи с этим, указанные методы могут быть использованы в лабораторной практике. Преимуществом применения биочипов является простота метода, возможность идентификации микобактерий непосредственно в клиническом материале и автоматизированный учет результатов.
При неоднократном обнаружении в материале, полученном от больного, одного и того же вида НТМ, при отсутствии M. tuberculosis и наличии клинико-рентгенологических проявлений заболевания, лечащим врачам в диагностическом ряду следует рассматривать микобактериоз.
При проведении химиотерапии микобактериозов следует учитывать, что НТМ в большинстве случаев устойчивы к основным и резервным противотуберкулезным препаратам и чувствительны к таким фторхинолонам, как ципрофлоксацин и моксифлоксацин.
Создана коллекция из 548 клинических изолятов нетуберкулезных микобактерий (относящихся к 14 видам), идентифицированных с помощью микробиологических, молекулярно-генетических методов и ВЭЖХ, которая может быть использована в качестве контрольной при разработке или испытании новых диагностических тест-систем.
Результаты настоящей работы внедрены в практическую деятельность Централизованной микробиологической лаборатории Московского научно-практического центра борьбы с туберкулезом (МНПЦБТ), обслуживающей Центр и противотуберкулезные диспансеры города Москвы. Они вошли в курс лекций и практических занятий на кафедре фтизиопульмонологии РМАПО.
На основании проведенных исследований составлены и изданы методические рекомендации:
- «Определение вида микобактерий комплексов MAIS и Mycobacterium tuberculosis методом рестрикционного анализа», утвержденные Департаментом здравоохранения города Москвы 07.02.2007;
- «Идентификация микобактерий методом высокоэффективной жидкостной хроматографии», утвержденные Департаментом здравоохранения города Москвы 21.05.2009;
- «Выделение и идентификация нетуберкулезных микобактерий микробиологическими методами», утвержденные Департаментом здравоохранения города Москвы 21.05.2009г.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Использование модифицированной жидкой питательной среды Миддлбрука 7Н9 (в автоматизированной системе BACTEC MGIT 960) в сочетании с одной из плотных (агаровой или яичной) питательных сред является оптимальным для выделения НТМ из клинического материала.
2. Разработанный, путем поэтапного анализа различных модификаций с увеличением количества специфических олигонуклеотидов, иммобилизированных в лунках с гелем, метод биологических микрочипов (БИОЧИП «IMS») является достоверным, простым и быстрым методом идентификации микобактерий видов: M. avium, M. intracellulare, M. sсrofulaceum, M. kansasii, M. gordonae, M. xenopi, M. marinum, M. fortuitum, M. chelonae) и дифференциации их от M. tuberculosis complex (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG).
3. Анализ сравнительного изучения эффективности видовой идентификации микобактерий с помощью биочипов, метода ПДРФ, ВЭЖХ и микробиологических методов, показал, что все эти методы дают сопоставимые результаты. При этом ВЭЖХ и молекулярно-генетические тесты характеризуются более высокой специфичностью и скоростью получения результатов, а преимуществом биочипов также является автоматизированный учет с помощью программного обеспечения и возможность идентификации непосредственно в клиническом материале.
4. Разработан алгоритм выделения и идентификации НТМ, применение которого в лабораторной практике позволит улучшить диагностику микобактериозов. Он включает: культивирование биологического материала на двух питательных средах (жидкой и плотной); идентификацию выделенной культуры микобактерий методом ВЭЖХ и/или одним из молекулярно-генетических методов (ПДРФ и БИОЧИП-IMS); субкультивирование на чашках с агаровой средой 7Н11 для обнаружения смешанных культур микобактерий и проведения (в случаях необходимости) идентификации вида микробиологическими методами.
5. При использовании предложенного алгоритма выделения и идентификации НТМ охарактеризован их видовой состав в городе Москве: с наибольшей частотой из медленнорастущих НТМ в клиническом материале обнаружены МАС, M. kansasii и M. xenopi, а из быстрорастущих – M. fortuitum. Неоднократное обнаружение в диагностическом материале, полученном от больного, одного и того же вида НТМ (при отсутствии M. tuberculosis) и наличие соответствующей клинико-рентгенологической симптоматики дает основание для рассмотрения в диагностическом ряду микобактериоза.
6. НТМ, выделенные от больных туберкулезом и лиц с подозрением на туберкулез в городе Москве, отличаются высоким уровнем устойчивости как к основным, так и резервным противотуберкулезным препаратам, и в большинстве случаев чувствительны к таким фторхинолонам, как ципрофлоксацин и моксифлоксацин.
Апробация работы
Материалы диссертации представлены на научных форумах всероссийского и международного уровней, включая научно-практические конференции и заседания Ученого совета МНПЦБТ, 8-й Российский съезд фтизиатров (Москва, 2007 г.), Всероссийскую научно-практическую конференцию «Актуальные вопросы лечения туберкулеза различных локализаций» (Санкт-Петербург, 2008 г.), 4-й конгресс Евро-Азиатского респираторного общества и 5-й Международный конгресс пульмонологов Центральной Азии (Ташкент, 2008 г.), 7-ю и 8-ю Московские Ассамблеи «Здоровье Столицы» в 2008 г. и 2009 г., Европейские респираторные конгрессы (Берлин 2008 г., Вена 2009 г.), 5-й конгресс Международного противотуберкулезного союза (Дубровник 2009 г.).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 28 работ, в том числе одна книга, 9 статей в изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования РФ.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 218 страницах машинописного текста по традиционному плану и включает введение, обзор литературы, главу «Материал и методы», четыре главы собственных исследований, заключение, выводы, практические рекомендации, список литературы, содержащий ссылки на 37 работ отечественных и 305 зарубежных авторов. Результаты исследования проиллюстрированы 20 рисунками, в виде графиков, схем, фотографий и 18 таблицами.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
1. Клинические и лабораторные штаммы микобактерий
Исследования проведены в Централизованной микробиологической лаборатории МНПЦБТ и основаны на результатах изучения клинических образцов, поступивших из противотуберкулезных учреждений города Москвы за период с января 2006 г. по ноябрь 2009 г. Всего за этот период исследовано 163766 образцов биологического материала, выделены 13283 культуры микобактерий, из которых к НТМ отнесено 764, что составило 5,8%. Из них 548 клинических изолятов НТМ относящихся к 14 видам, охарактеризованные не только микробиологическими, но и одним или двумя молекулярно-генетическими методами и/или ВЭЖХ, находятся в коллекции МНПЦБТ.
В качестве контролей использовали лабораторные штаммы микобактерий, находящиеся в музее Централизованной микробиологической лаборатории МНПЦБТ: M. tuberculosis H37Rv, M. bovis Ravenel, M. bovis BCG, M. avium, M. intracellularae, M. scrofulaceum, M. kansasii, M. marinum, M. fortuitum, M. chelonae, M. gordonae, M. smegmatis, M.terrae, M. xenopi, M. malmoense, M. gastri, M. simiae, M. phlei, M.vacca, M.flavescense. Штаммы получены из ГИСК им. Л.А.Тарасевича (Москва), НИИ фтизиопульмонологии (Санкт-Петербург) от профессора Т.Ф. Оттен и из НИИ лепры (Астрахань). Эталонные штаммы M. avium ATCC 35712, M. intracellularae ATCC 35761, M. kansasii ATCC 25101, M. marinum ATCC 11565, M. fortuitum ATCC 14467, M. gordonae 14470 получены из микобактериологической лаборатории Еврейского медицинского исследовательского центра (Денвер, Колорадо, США) от профессора Л. Хейфеца.
2. Выделение и идентификация НТМ
Выделение микобактерий проводили микробиологическими методами на плотной яичной питательной среде Левенштейна-Йенсена (Л-Й), на чашках с агаровой средой Миддлбрука 7Н11, разделенных на 2 сектора: с антибиотиками/без антибиотиков (с антибиотиками – 7Н11 селективный агар – для подавления роста посторонней микрофлоры и получения чистой культуры микобактерий, без антибиотиков – для выделения штаммов микобактерий, рост которых могут ингибировать антибиотики), а также в модифицированной жидкой питательной среде Миддлбрука 7Н9 в автоматизированной системе BACTEC MGIT 960 (Becton Dickinson).
Биологический материал, полученный от обследуемых лиц: мокрота, промывные воды бронхов, бронхоальвеолярный лаваж, плевральная жидкость, моча, материал биопсии, и т.д., перед посевом на питательные среды для уничтожения неспецифической микрофлоры и разжижения подвергали щадящей обработке с помощью Myco-Prep-реагента (BBL), содержащего N-аcetyl-L-cysteine (NALC) и 3% NaOH. Все образцы микроскопировали на наличие кислотоустойчивых микроорганизмов после окраски флюорохромами.
Идентификацию выделенных культур микробиологическими методами проводили в соответствии с приказом МЗ РФ № 109 от 21 марта 2003г. «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации». Вначале культуры кислотоустойчивых микроорганизмов по морфологии колоний и способности к пигментообразованию на плотных и «косообразованию» (результаты микроскопии) в жидкой питательных средах предварительно делили на две группы: M. tuberculosis complex и НТМ. Затем проводили их дальнейшую идентификацию, основанную на оценке скорости роста, способности роста при различных температурах, в присутствии салицилового натрия, 5% NaCl и изучении их биохимических свойств: способности к восстановлению нитратов, теллурита калия; гидролизу Твина-80; никотинамидазной, арилсульфатазной, каталазной активности и др. С целью сокращения времени получения результатов идентификации биохимическими методами для постановки нитратредуктазного и ниацинового тестов использовали первичные культуры микобактерий, выделенные в жидких питательных средах.
Для хроматографического и молекулярно-генетических анализов использовали культуры микобактерий, выделенные в жидкой и на плотных питательных средах, в которых наличие кислотоустойчивых микроорганизмов и отсутствие контаминации подтверждали микроскопией мазков, окрашенных по Циль-Нильсену. Для подтверждения наличия в культуре одного вида микобактерий и их идентификации микробиологическими методами, проводили субкультивирование на чашках с агаровой средой Миддлбрука 7Н11.
3. Идентификация микобактерий методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)
Идентификацию микобактерий методом ВЭЖХ выполняли по методике, основанной на анализе различий в составе миколовых кислот клеточной стенки, разработанной центром по контролю и предотвращению заболеваний (CDC, USA, 1996) и предложенной для использования, как стандартного метода определения видов, входящих в род Mycobacterium, в микобактериологических референс-лабораториях. Разделение миколовых кислот осуществляли методом обращенно-фазовой хроматографии с помощью хроматографической системы Breeze Waters, состоящей из бинарного градиентного насоса, модуля для автоматического ввода проб, модуля для подогрева колонки, многоволнового флюоресцентного детектора, колонки Symmetry C18 5мМ 3,9×50 мм с предколонкой.
4. Идентификация микобактерий молекулярно-генетическими методами
В сотрудничестве с институтом молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН последовательно разработаны экспериментальные версии биологических микрочипов «IMS», предназначенные для идентификации M. tuberculosis и ряда видов НТМ.
Метод включает в себя двухстадийную ПЦР. На первой стадии проводили амплификацию исследуемых фрагментов gyrB гена. На второй стадии использовали ДНК из амплифицированных образцов и дезоксинуклеотид, меченый флуоресцентной меткой CY-5. Полученные ПЦР продукты гибридизовали на чипе, содержащем набор олигонуклеотидов, специфичных для gyrB регионов разных видов микобактерий. Процедуру гибридизации проводили в камере в течение 16-18 часов при 37о.
Интерпретацию результатов гибридизации осуществляли при сравнении интенсивности флуоресцентных сигналов в ячейках, содержащих видоспецифические олигонуклеотиды, с помощью специального программного обеспечения «Imageware» (ИМБ РАН, Россия). Максимальный флуоресцентный сигнал свидетельствовал о наличии совершенного гибридизационного дуплекса.
Идентификация НТМ с помощью ПДРФ также включала два последовательных этапа. На первом этапе проводили ПЦР фрагмента гена hsp65, на втором – осущуствляли рестрикционный анализ ампликонов, полученных после проведения ПЦР. Детекцию полиморфизма длин рестрикционных фрагментов проводили с помощью электрофореза в 3% агарозном геле в присутствии этидиума бромида при напряжении тока 10B/см в течение 10 минут, в однократном TВE буфере (0,089мМ трис-бората; 0,089М борной кислоты; 2мМ EDTA, рН 8,0). По окончании электрофореза гель просматривали в трансиллюминаторе в проходящем ультрафиолетовом свете. После обработки рестриктазой Hin6I на электрофорезе были видны четкие отличия разных видов микобактерий, в зависимости от числа пар нуклеотидов.
5. Определение лекарственной чувствительности культур нетуберкулезных микобактерий
Лекарственную чувствительность культур, выделенных на плотных и в жидкой питательных средах, из клинических образцов больных туберкулезом и лиц с подозрением на туберкулез, изучали методом абсолютных концентраций на плотной яичной питательной среде Левенштейна-Йенсена (Приказ МЗ РФ №109 от 21.03.03г.).
6. Статистическая обработка результатов
Для обработки информации была сформирована база данных (формат Excel), включавшая паспортную информацию о пациентах, сведения о цели исследования, характере диагностического материала, диагнозе и проведенном лечении, результатах микробиологического и молекулярно-генетических исследований. Оценку достоверности различия качественных признаков и долей в группах проводили с использованием критерия Фишера (для двух параметров) и χ2-критерий (для трех и более параметров). В качестве критического уровня достоверности различий принят р = 0,05. [Наглядная статистика в медицине/А. Петри, К. Сэбин//Пер. с англ. В.П. Леонова.- М.: ГЭОТАР-МЕД, 2003.- 144С.].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Настоящая работа посвящена проблемам разработки и внедрения оптимального комплекса методов выделения и идентификации НТМ. Следует подчеркнуть, что данные о том, каким должен быть оптимальный комплекс (даже только микробиологических методов), который можно рекомендовать для этих целей, в отечественной литературе отсутствуют, а разные зарубежные авторы имеют неодинаковые мнения по этой проблеме. Что касается ВЭЖХ и молекулярно-генетических методов, то в абсолютном большинстве исследований были охарактеризованы возможности применения только одного из них, без определения его места в системе (алгоритме) выделения и идентификации НТМ.
1. Выделение и микробиологическая идентификация видов НТМ
1.2. Сравнительное изучение эффективности выделения НТМ на разных средах
Настоящее исследование проведено для сравнения эффективности выделения микобактерий на разных питательных средах: плотной яичной – Левенштейна-Йенсена (Л-Й), модифицированной жидкой Миддлбрука 7Н9 (7Н9) в автоматизированной системе BACTEC MGIT 960 и чашках с плотной агаровой средой Миддлбрука 7Н11 (7Н11).
Произведено 2029 посевов, выделено 227 культур микобактерий, из них как M. tuberculosis complex идентифицировано 186 культур (81,9%) и 41 (18,1%) – как НТМ (MAC – 17, M. kansasii – 8, M. xenopi – 6, M. fortuitum – 10).
Таблица 1.
Эффективность выделения микобактерий на разных питательных средах
| Вид микобактерий | Число (%) изолятов микобактерий, выделенных на среде: | Достоверность различий (р) | ||
| Левенштейна-Йенсена (1) | Миддлбрука 7Н11 (2) | Миддлбрука 7Н9 (BACTEC MGIT 960) (3) | ||
| M. tuberculosis (186) | 139 (74,7) | 150 (80,6) | 169 (90,9) | p1-2 > 0,1 p1-3 < 0,01 p2-3 < 0,01 |
| МАС (17) | 10 | 11 | 14 | |
| M. kansasii (8) | 5 | 6 | 7 | |
| M. xenopi (6) | 5 | 5 | 5 | |
| M. fortuitum (10) | 7 | 7 | 9 | |
| Всего НТМ (41) | 27 (65,9) | 30 (73,2) | 35 (85,4) | p1-2 > 0,1 p1-3 < 0,05 p2-3 > 0,1 |
| ИТОГО (227) | 166 (73,1) | 180 (79,3) | 204 (89,9) | p1-2 > 0,1 p1-3 < 0,01 p2-3 < 0,01 |