Идентификация и внутривидовое типирование возбудителей сапа и мелиоидоза 03. 00. 07 микробиология 03. 00. 15 генетика

Вид материала

Автореферат

Содержание Научные консультанты Официальные оппоненты Ведущая организация Общая характеристика работы B. pseudomallei Цель работы Задачи исследования Научная новизна 23S рРНК, флагеллярного гена и orf Практическая ценность Положения, выносимые на защиту Апробация работы Структура и объем работы Содержание работы 2. Идентификация и внутривидовое типирование патогенных буркхольдерий на основе фенотипических признаков 3. Фенотипическая и генотипическая идентификация бактерий комплекса B.cepacia, B. thailandensis, B.pseudomallei-like spp. B.cepacia, B.thailandensis 4. Разработка молекулярно-генетических способов детекции патогенных буркхольдерий Характеристика используемых олигонуклеотидных праймеров Cgaagctgcggatgcgagctagtctc agtcgcagccaccagtttattgcaacc ... Полное содержание

Подобный материал:

• Контрольная работа по дисциплине Микробиология По теме Общая и специальная микробиология, 208.97kb.
• Рабочая программа генетика Код дисциплины по учебному плану опд ф. 6 для студентов, 274.5kb.
• Выделение и идентификация нетуберкулезных микобактерий у пациентов фтизиатрических, 706.97kb.
• Генетика Генетика, 18.18kb.
• Программа элективного курса по биологии для учащихся 10-х классов химико-биологического, 154.46kb.
• Разработка лабораторных экспресс-методов и технологии производства иммунодиагностических, 571.84kb.
• Темы: общая генетика, генетика человека, медицинская генетика. Вопросы для самоподготовки., 39.67kb.
• Примерная программа дисциплины микробиология, вирусология, микробиология полости рта, 447.35kb.
• Молекулярные механизмы формирования множественной лекарственной резистентности у Burkholderia, 787.44kb.
• Прототипы сибиреязвенных вакцин на основе генно-инженерных бациллярных штаммов и синтезируемых, 655.67kb.

На правах рукописи

АНТОНОВ Валерий Алексеевич

ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ВНУТРИВИДОВОЕ ТИПИРОВАНИЕ

ВОЗБУДИТЕЛЕЙ САПА И МЕЛИОИДОЗА


03.00.07 – микробиология

03.00.15 – генетика


Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук


Волгоград – 2009


Работа выполнена в ФГУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.


Научные консультанты:


доктор медицинских наук,

профессор Алексеев Владимир Валерьевич


доктор медицинских наук,

профессор Замараев Валерий Семенович


Официальные оппоненты:


доктор медицинских наук, профессор Швиденко Инна Григорьевна


доктор медицинских наук, доцент Бойко Андрей Витальевич


доктор медицинских наук, с.н.с. Пятков Владимир Анатольевич


Ведущая организация: ФГУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора


Защита состоится « _» ___________ 2009 г. в ____часов на заседании диссертационного совета Д 208.078.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46).


Автореферат разослан «____» _____________2009 г.


С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб».


Учёный секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук,

старший научный сотрудник А.А. Слудcкий


ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Burkholderia mallei и Burkholderia pseudomallei вызывают заболевания сап и мелиоидоз, признаваемые как самостоятельные нозологические единицы. Эти возбудители относятся ко II группе патогенности и, по мнению отечественных и зарубежных специалистов, являются потенциальными агентами биотерроризма (Wheelis M., 1998; Lehavi O., et al., 2002; Алексеев В.В. с соавт., 2003; Bossi P. et al., 2004; Ruppitsch W. et al., 2007). Исследовательские работы с использованием патогенных биологических агентов создают реальную опасность внутрилабораторных заражений персонала, а также угрозу аварий на объектах, где проводятся работы с патогенными микроорганизмами (Srinivasan A. et al., 2001; Currie B. J. et al., 2003).

Сегодня в мире проблема сапа не стоит так остро, как ранее, что связано с уменьшением численности лошадей, являющихся основным резервуаром этой инфекции, однако сап по-прежнему наносит значительный экономический урон в крупных животноводческих хозяйствах Турции, Ирана, Объединенных Арабских Эмиратов, Афганистана, Индии, Китая, Монголии, а также стран Африки и Латинской Америки (Arun S. et al., 1999; Anuntagool N. et al. 2002; Nierman W.C. et al. 2004; Harvey S.P. 2005; Scholz H.C. et al., 2006). Заболеваемость сапом среди людей носит, в основном, спорадический характер. В то же время, возбудитель сапа крайне опасен в лабораторных условиях. Это подтверждает трагический опыт большого количества исследователей сапа (Вышелесский С.Н., 1909; Srinivasan A. et al., 2001).

Ранее считалось, что мелиоидоз единственное заболевание, вызываемое буркхольдериями, распространение которого в природе имеет определенные географические границы: оно эндемично лишь для Австралии и стран Юго-Восточной Азии (Cravitz L. 1950; Rogul M. et al., 1970; Ширяева Д.Т. 1976). На сегодняшний день эта точка зрения изменилась. В настоящее время мелиоидоз обнаружен далеко за пределами эндемичных территорий Азии и Австралии (Cheng A. C., 2005), спорадические случаи и очаги мелиоидоза выявлены в странах Центральной и Южной Америки, Западной Африки и даже в Европе (Dance D.A., 2000; Carlson P., 2001; Heyse A.M. et al., 2003; Dance D.A. et al., 2004; Issack M.I. et al., 2005; Rolim D.B., 2005). Причем, в Cальвадоре и Чили возбудитель мелиоидоза признан как этиологический агент нозокомиальных и оппортунистических инфекций с неблагоприятным прогнозом (Cheng A. C., 2005). Большинство случаев, зарегистрированных за пределами эндемичных территорий, связано с пребыванием в Юго-Восточной Азии и Австралии туристов, имевшими прямой контакт с контаминированной B.pseudomallei пылью или водой (Currie B. J., 2003; Dance D.A. et al., 2004; Maccanti O. et al., 2004; Kateruttanakul P. et al., 2005; Mandjee A., 2005; Shrestha N., 2005). Риск заражения мелиоидозом увеличивается в период природных катастроф (Allworth A.M., 2005; Chierakul W. et al., 2005).

Актуальность создания эффективных средств диагностики сапа и мелиоидоза определяется реальной угрозой возникновения в любом регионе мира неблагоприятной эпидемической ситуации по этим инфекциям в связи со значительным ростом грузо- и пассажиропотоков, появления возбудителей за счёт завоза больных животных, а также пищевых продуктов, контаминированных патогенными буркхольдериями. Способность к длительной бессимптомной персистенции возбудителя мелиоидоза в организме являются дополнительными причинами расширения ареала инфекции в результате миграции людей и животных с латентной формой заболевания (Koponen M.A., 1991; Riecke K. et al., 1997; Ngauy V. et al., 2005; Frangoulidis D. et al., 2007).

На сегодняшний день можно констатировать, что существующие методы обнаружения патогенных буркхольдерий оказываются недостаточно эффективными для экспресс-диагностики, а идентификация возбудителей сапа и мелиоидоза по-прежнему является трудоемкой задачей. Традиционная лабораторная диагностика, направленная на выделение чистой культуры возбудителей с последующей ее идентификацией, позволяет дать положительный ответ лишь через 36-48 ч. Серологические методики дают более быстрые результаты, но обладают относительно низкой чувствительностью и недостаточной специфичностью из-за возможных перекрёстных реакций с гетерологичными видами микроорганизмов и антигенной вариабельности штаммов. Кроме того, диагностическая ценность иммунологических методов ограничена при выявлении патогенных буркхольдерий на ранних стадиях инфекционного процесса.

Бурное развитие молекулярно-генетических технологий и достижения современной фундаментальной науки внесли значительный вклад в совершенствование средств диагностики, профилактики и лечения инфекционных болезней. Изучение геномов возбудителей особо опасных инфекций, включая B. mallei и B. pseudomallei привело к созданию и широкому внедрению новых методических подходов, направленных на идентификацию и типирование патогенов. Однако отсутствие общепринятых коммерческих тест-систем, предназначенных для выявления видоспецифических последовательностей ДНК и антигенов этих микроорганизмов, приводит к тому, что в рутинной практике до сих пор используют лишь микроскопию и биохимические системы идентификации подобные API 20NE (Zysk G., 2000; Cheng A. C., 2005). Молекулярно-биологические методы обнаружения патогенных буркхольдерий включают в схему лабораторной диагностики в качестве подтверждающих тестов, как правило, при положительных находках в полуавтоматических системах идентификации (Srinivasan A., 2001; Inglis T.J.J. et al., 2005).

Традиционные методы типирования штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза, основанные на культивировании микроорганизмов, изучении особенностей их метаболизма и антигенного строения, различной чувствительности к бактериофагам и антибиотикам (Манзенюк О.Ю. c соавт., 1994; Илюхин В.И. c соавт., 1995; Гришкина Т.А., 1996; Пивень Н.Н. , 1997; Илюхин В.И. c соавт., 1998), отличаются ресурсоемкостью и в большинстве случаев не позволяют выявить отличия между штаммами патогенных буркхольдерий. Данные методы, основанные на изучении фенотипических свойств, имеют существенные недостатки, связанные с относительной однородностью фенотипических свойств штаммов этих видов микроорганизмов, что определяет трудности в их инфравидовой дифференциации. В связи с этим, на сегодняшний день ни один из фенотипических маркеров не обеспечивает необходимую эффективность при расшифровке вспышек сапа и мелиоидоза.

В последние годы среди используемых методов типирования главенствующее место стали занимать молекулярно-биологические подходы. Результаты генотипирования характеризуются большей достоверностью по сравнению с морфологическими, биохимическими или иммунологическими методами дифференциации микроорганизмов (Блохина И.Н. c соавт., 1992; Tenover F.C.,1997; Шагинян И.А., 2000). Методы генетического типирования – полиморфизм длин рестрикционных фрагментов, гель-электрофорез в пульсирующем электрическом поле, различные варианты полимеразной цепной реакции и мультилокусного сиквенс-типирования были адаптированы для дифференциации штаммов B. pseudomallei, выделенных из внешней среды, от животных и человека (Trakulsomboon S. et al., 1994; Haase A. et al., 1995; Trakulsomboon S. et al., 1997; Currie B.J. et al., 2000; Pitt T.L. et al., 2000), расшифровки вспышек мелиоидоза (Currie B.J. et al., 2001; Ulett G.C. et al., 2001) и оценки эффективности проводимой антибиотикотерапии (Vadivelu J. et al., 1997; Koonpaew S. et al., 2000). Следует отметить, что количество публикаций, в которых описаны методы типирования возбудителя сапа существенно меньше, чем его ближайшего «родственника» - возбудителя мелиоидоза (Harvey S.P., 2005; Chantratita N. et al., 2006; , U'Ren J.M. et al., 2007).

Применение автоматических секвенаторов и методологии биочипов позволило вплотную подойти к экспрессному секвенированию полного генома микроорганизмов. Информация, полученная при секвенировании геномов патогенных буркхольдерий, может быть использована для разработки быстрых и точных методов диагностики и дифференциации возбудителей сапа и мелиоидоза от близкородственных микроорганизмов, а также для внутривидового типирования этих патогенов.

До проведения полного сиквенса геномов B.pseudomallei и B.mallei лишь небольшая часть генов была клонирована и изучена их структурно-функциональная организация. Проведенные исследования геномной организации возбудителей сапа и мелиоидоза на основе секвенирования полных геномов показали наличие у них двух хромосом с функциональным разделением генов между ними (Holden M.T. et al., 2004; Nierman W.C. et al., 2004). Большие хромосомы кодируют функции, ответственные за основные стороны жизнеобеспечения и роста клеток, в то время как меньшие – несут вспомогательную нагрузку, заключающуюся в обеспечении адаптационных свойств микроорганизмов в части выживаемости в различных условиях окружающей среды. Первые аннотированные сиквенсы геномов B. mallei ATCC 23344 и B. pseudomallei K96243 представлены на веб-серверах (org/) и (ссылка скрыта). На сегодняшний день эти базы данных содержат информацию об аннотированных геномов уже 4 штаммов B. mallei  и 4 штаммов B. pseudomallei.

Анализ геномных последовательностей буркхольдерий выявил множество гомологичных участков у B.pseudomallei и B.mallei, отсутствующих у близкородственного вида B.thailandensis (Holden M.T. et al., 2004; Nierman W.C. et al., 2004). С помощью методологии секвенирования и технологии ДНК-биочипов идентифицировано большое количество открытых рамок считывания (ORF), которые делетированы (дефектны) у B.mallei и B.thailandensis в сравнении с B.pseudomallei. Как для B. mallei, так и для B.thailandensis выявлена преимущественная локализация таких генов на малой хромосоме. Как правило, они связаны с различными метаболическими и клеточными функциями, определяющими межвидовые различия (Ong C. et al., 2004; Kim H.S. et al., 2005). Причем, у возбудителя сапа отмечена высокая тенденция к потере более протяженных фрагментов хромосом. Делеции затрагивают некоторые гены III типа секреции, сериновой металлопротеазы, кластеров, детерминирующих гликопротеиновую капсулу, а также продукцию и секрецию токсинов.

Расшифровка и сопоставление полногеномных последовательностей различных штаммов B. pseudomallei и B. mallei позволяет определять ДНК-маркеры (ДНК-стандарты) с которыми можно проводить сравнение остальных штаммов и изолятов с тем, чтобы делать выводы о присутствующих или отсутствующих в них последовательностях, по сравнению со стандартами.

Однако на сегодняшний день такая информация имеется лишь для нескольких штаммов из большого разнообразия диких штаммов и поиск вариабельных ДНК-маркеров для внутривидовой дифференциации патогенных буркхольдерий проводится эмпирически.

Существующая вероятность завоза инфекций на территорию нашей страны диктует необходимость технологических разработок, удовлетворяющих задачам не только высокоэффективной идентификации, но и дифференциации штаммов B.mallei и B.pseudomallei. В настоящее время основополагающий подход к детекции и анализу возбудителей инфекций состоит в последовательном применении методов и средств диагностики, в комплексе представляющих собой единую систему, включающую специфическую индикацию, идентификацию патогена и типирование выявленного микроорганизма. Для многих видов микроорганизмов, в том числе возбудителей особо опасных инфекций, разработаны необходимые алгоритмы идентификации и дифференциации штаммов, основанные на фенотипических и генотипических признаках. Многообразие клинических форм и отсутствие патогномоничных симптомов сапа и мелиоидоза практически исключают возможность постановки диагноза только на основании клинической картины, в связи с этим возрастает роль лабораторных методов в верификации диагноза. Возникающие проблемы их диагностики как в эндемичных, так и неэндемичных регионах определяют необходимость совершенствования лабораторного анализа и создания единой многоуровневой системы генодиагностики и внутривидовой дифференциации возбудителей.

Рассматривая современные методы идентификации и генотипирования штаммов патогенных буркхольдерий следует отметить, что на сегодняшний день отсутствует оптимальная схема ускоренного выявления внутривидовых различий B. pseudomallei и B. mallei, а поиск генетических маркеров для быстрого генотипирования штаммов патогенных буркхольдерий продолжается вплоть до настоящего времени.

На основании вышеизложенного, очевидна актуальность научных исследований, направленных на более детальное изучение возбудителей сапа и мелиоидоза, их консервативных и вариабельных последовательностей с целью создания высокоэффективных генетических систем идентификации, отвечающих современным требованиям к чувствительности и специфичности диагностических тест-систем, а также разработки генотипических методов внутривидовой дифференциации штаммов B.mallei и B.pseudomallei.


Цель работы заключалась в разработке способов генной диагностики, конструировании амплификационных тест-систем для идентификации патогенных буркхольдерий и совершенствовании схем внутривидового типирования штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза с применением методов молекулярной биологии.


Задачи исследования:

1. Провести анализ нуклеотидных последовательностей, представленных в различных генетических базах данных, с целью подбора перспективных ДНК-мишеней для генной диагностики и генетической дифференциации штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза в различных вариантах ПЦР-анализа, моно- и мультилокусного сиквенс-типирования.
   
2. Сконструировать амплификационные тест-системы для выявления возбудителей сапа и мелиоидоза методом ПЦР, подобрать условия проведения реакции, оценить чувствительность и специфичность генодиагностических систем на широком наборе гомологичных и гетерологичных штаммов микроорганизмов.
   
3. Оптимизировать условия подготовки проб для исследования экспериментального биологического материала при различных клинических формах сапа и мелиоидоза и проб из объектов внешней среды, контаминированных B. mallei и B. pseudomallei.
   
4. Оценить эффективность ДНК-зондов на основе хромосомной ДНК патогенных буркхольдерий и криптических плазмид возбудителя мелиоидоза для идентификации B. mallei и B. pseudomallei и исследования атипичных штаммов патогенных буркхольдерий методом ДНК-ДНК гибридизации.
   
5. С помощью молекулярно-генетических методов изучить вариабельность геномов типичных и атипичных штаммов B. mallei и B. pseudomallei при различных условиях культивирования in vitro и экспериментальной инфекции и выбрать наиболее эффективные методы генетического типирования штаммов патогенных буркхольдерий.
   
6. Провести сравнительный анализ эффективности фенотипических и молекулярно-биологических методов идентификации и внутривидовой дифференциации штаммов B. mallei и B. pseudomallei и определить оптимальный алгоритм генодиагностики и генотипирования патогенных буркхольдерий.
   

Научная новизна:


В представленной работе впервые проведено комплексное исследование вариабельных фенотипических признаков и генотипических свойств возбудителей сапа и мелиоидоза с применением широкого спектра методов структурной геномики, позволившее решить ряд прикладных задач, направленных на совершенствование схем идентификации и генетического типирования патогенных буркхольдерий.

Получены приоритетные данные об использовании нуклеотидных последовательностей генов, детерминирующих 23S рРНК, флагеллярного гена и orf гена III типа секреции для идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза и на основе этих генов впервые сконструированы отечественные высокочувствительные и специфичные амплификационные тест-системы для генодиагностики B.pseudomallei и B.mallei.

Впервые показана возможность использования ПЦР в качестве дополнительного метода идентификации при различных формах сапа и мелиоидоза, вызванных типичными и атипичными штаммами B. pseudomallei и B. mallei.

Впервые предложены группоспецифические олигонуклеотидные затравки burts1/burta2 для выявления триады буркхольдерий - B.pseudomallei, B.mallei и B.thailandensis, используемые в сочетании с методом ДНК-ДНК гибридизации и амплификации с произвольными праймерами для оценки генетического полиморфизма штаммов B.thailandensis, в том числе штамма B.thailandensis КМ-161, рекомендованного в качестве имитатора возбудителя мелиоидоза при проведении учебных занятий по идентификации ООИ методом ПЦР (патент на изобретение Российского агентства по патентам и товарным знакам «Штамм бактерий Burkholderia thailandensis КМ 161 – авирулентный имитатор возбудителя мелиоидоза» Российского агентства по патентам и товарным знакам N 2257413.от 27.07.2005 г.).

Представлены доказательства того, что алгоритмом ускоренной идентификации B. mallei и B. pseudomallei является сочетание реакции амплификации и последующего секвенирования фрагментов генов 16S рРНК, 23S рРНК, orf13 и fliC. Для доказательства достоверности ПЦР-диагностики сапа и мелиоидоза предложено секвенирование двух локусов геномной ДНК – фрагмента гена 16S рРНК и участков генов 23S рРНК, orf13 или fliC.

Показано, что разработанный метод выделения ДНК из объектов окружающей среды (почва, вода), искусственно контаминированных микромицетами (патент на изобретение Российского агентства по патентам и товарным знакам №2295569 от 12. 07. 2005 г.), эффективен для экстракции и очистки ДНК патогенных буркхольдерий.

Впервые предложен способ проведения плазмидного анализа для внутривидового типирования штаммов возбудителя мелиоидоза. Приоритетность исследований подтверждена патентом на изобретение «Способ выделения плазмид Burkholderia pseudomallei» Российского агентства по патентам и товарным знакам № 2218401 от 10.12.2003 г.

Оптимизированы условия проведения рестрикционного анализа ДНК возбудителя сапа и впервые оценена генетическая гетерогенность коллекционных штаммов B.mallei методом пульс-электрофореза.

Впервые проведен анализ изолятов возбудителя сапа на основе реакции амплификации с произвольными праймерами и показана высокая эффективность ПЦР-типирования штаммов B.mallei. Для дифференциации штаммов патогенных буркхольдерий с использованием полимеразной цепной реакции предложен оригинальный набор олигонуклеотидных затравок.

Научная новизна исследования связана с определением вариабельных нуклеотидных последовательностей и тандемных повторов коллекционных штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза, на основе которых возможно проведение ускоренного генетического типирования штаммов B.pseudomallei и B.mallei.

С помощью мультилокусного сиквенс-типирования и сравнительного анализа секвенированных последовательностей вариабельных участков генов «домашнего хозяйства» впервые установлено, что штаммы коллекционного центра живых культур Волгоградского научно-исследовательского противочумного института B.pseudomallei 100, С-141, а также B.pseudomallei 107 с неизвестным источником выделения, относятся к Юго-Восточной группе.

Проведенные исследования впервые позволили сформировать единую систему генодиагностики и генотипирования штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза. Схема лабораторной диагностики и идентификации патогенных буркхольдерий дополнена методом ПЦР c разработанными амплификационными тест-системами и впервые предложена схема быстрого внутривидового генетического типирования штаммов B.mallei и B.pseudomallei.

Разработанные методические подходы легли в основу исследований, поддержанных грантами РФФИ 04-04-96503, 07-04-01568 и 07-04-08665.


Практическая ценность:


Разработанные амплификационные тест-системы в настоящее время используются в лабораториях Волгоградского НИПЧИ и могут быть рекомендованы для специализированных лабораторий для идентификации патогенных буркхольдерий и экспресс-диагностики сапа и мелиоидоза. С этой целью оформлены методические рекомендации «Идентификация возбудителей сапа и мелиоидоза методом полимеразной цепной реакции», утвержденные директором института Н.Г. Тихоновым 29 мая 2002 г. и методические рекомендации «Использование двух пар праймеров для идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза методом ПЦР» (утверждены директором Волгоградского НИПЧИ В.В. Алексеевым 10 февраля 2005 г.).

Материалы диссертационной работы использованы при оформлении пакета первичной документации: «Инструкция по изготовлению и контролю амплификационной тест-системы для выявления Burkholderia pseudomallei и Burkholderia mallei» и «Инструкция по применению амплификационной тест-системы для выявления Burkholderia pseudomallei и Burkholderia mallei», утверждённой директором Волгоградского НИПЧИ В.В. Алексеевым 10 февраля 2005 г.

Методики плазмидного анализа, выделения и мобилизации внехромосомных репликонов B.pseudomallei, включенные в методические рекомендации «Применение мобилизации для передачи криптических плазмид B.pseudomallei в гетерологичные виды», утвержденные директором Волгоградского НИПЧИ Н.Г.Тихоновым 20 апреля 1998 г. и методические рекомендации «Способ получения штамма кишечной палочки, продуцирующего белок 30 kDa, опосредованный мелиоидозной плазмидой рСМ2» (утверждены директором Волгоградского НИПЧИ Н.Г.Тихоновым. 2 марта 2000 г.) используются в лабораториях Волгоградского НИПЧИ в различных разделах работ при изучении патогенных буркхольдерий.

Используемый метод ДНК-гибридизации включен в схему идентификации патогенных буркхольдерий, представленную в практическом руководстве «Мелиоидоз. Лабораторная диагностика возбудителей особо опасных инфекционных болезней» (Саратов, 1998). В государственной коллекции патогенных бактерий Всесоюзного НИПЧИ «Микроб» депонированы штаммы E.coli КМ 163, 164, 165, 166, несущие в составе своего генома, фрагменты плазмиды рСМ2 возбудителя мелиоидоза, которые рекомендованы в качестве группоспецифических ДНК – зондов для идентификации патогенных буркхольдерий.

Результаты сравнительного анализа фенотипических и генотипических методов дифференциации типичных и атипичных штаммов патогенных буркхольдерий легли в основу методических рекомендаций «Постановка диагностических тестов для внутривидовой дифференциации штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза (индивидуальная карта штамма)», утвежденных директором Волгоградского НИПЧИ В.В.Алексеевым 25 июня 2003 г.

По материалам диссертационной работы составлены методические рекомендации: «Молекулярно-биологические подходы к идентификации и внутривидовому типированию возбудителей сапа и мелиоидоза», утвержденные директором Волгоградского НИПЧИ В.В. Алексеевым 06 марта 2006 г.

Предлагаемые схемы ПЦР-типирования с набором произвольных праймеров и олигонуклеотидных затравок для детекции вариабельных ампликонов, а также методы мультилокусного сиквенс-типирования и пульс-электрофореза используются в лабораториях Волгоградского НИПЧИ для сравнительного анализа музейных штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза и их изогенных мутантов с измененной вирулентностью и чувствительностью к антибиотикам.

Материалы диссертационной работы используются сотрудниками института в рамках учебных программ по первичной специализации и перепоготовке специалистов - Программы курсов повышения квалификации бактериологов и эпидемиологов по противодействию биотерроризму, утвержденной Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 01.02.2001 г., Программы курсов повышения квалификации врачей – бактериологов общей медицинской сети, центров госсанэпиднадзора и противочумных учреждений по специфической индикации и лабораторной диагностике особо опасных инфекций, санитарной охране территории и противоэпидемической защите населения, утвержденной Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 28.09.1999 г., а также Программы курсов повышения квалификации медицинских работников (с высшим и средним специальным образованием) санитарно-карантинных пунктов и отделов (СКП и СКО), утвержденной Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко. Кроме того, материалы настоящей работы используются при чтении лекций и проведении практических занятий для студентов III-VI курсов медико-биологического факультета Волгоградского государственного медицинского университета.

Положения, выносимые на защиту

1. Амплификационные тест-системы, сконструированные для выявления возбудителей сапа и мелиоидоза, обеспечивают специфическую детекцию фрагментов генов 23S рРНК, флагеллярного гена (fliC) и orf гена III типа секреции патогенных буркхольдерий при исследовании методом ПЦР чистых культур и проб из объектов внешней среды, контаминированных B. mallei и B.pseudomallei, а также при генодиагностике различных форм экспериментального сапа и мелиоидоза, вызванных типичными и атипичными штаммами возбудителей.
   
2. Группоспецифические олигонуклеотидные затравки burts1/burta2, обеспечивают амплификацию специфических фрагментов флагеллярного гена fliC триады буркхольдерий - B.pseudomallei, B.mallei и B.thailandensis с чувствительностью 1х10²-1х10³ м.к./мл при анализе чистых культур и биологического материала от экспериментально заражённых животных.
   
3. Использование двух ДНК мишеней - участков 16S рРНК и 23S рРНК, orf13 или fliC, при сочетании ПЦР и секвенирования является способом доказательства достоверности ПЦР-диагностики, быстрой идентификации B.mallei и B.pseudomallei и их дифференциации от близкородственных видов микроорганизмов.
   
4. Методы пульс-электрофореза и мультилокусного сиквенс-типирования эффективны для дифференциации штаммов возбудителя мелиоидоза, в отличие от штаммов B. mallei, для которых применим рестрикционный анализ ДНК в формате пульс-электрофореза. При мультилокусном сиквенс-типировании штаммы возбудителя сапа объединяются в единый сиквенс-тип, входящий в клональный комплекс штаммов B. pseudomallei и их дифференциация невозможна.
   
5. Быстрое генетическое типирование штаммов возбудителя мелиоидоза обеспечивают методы амплификации полиморфной ДНК с произвольными праймерами, VNTR-анализ, Rep-ПЦР и схема типирования на основе вариабельных ампликонов, а ускоренная оценка генетической гетерогенности штаммов возбудителя сапа возможна лишь с помощью VNTR-анализа и амплификации с произвольными праймерами.
   

Апробация работы


Основные материалы диссертации были представлены на международной конференции «Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины» (Москва, 2002), IV Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Москва, 2002), IV межгосударственной научно – практической конференции Государств стран СНГ «Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней» (Саратов, 2003), XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2004), V Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» (Москва, 2004), VI Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Санитарная охрана территорий государств участников Содружества Независимых Государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005), Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств»» (Оболенск, 2006), XI Региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области (Волгоград, 2006), 65-й юбилейной научно-практической конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Волгоград, 2007), V международном конгрессе по мелиоидозу (Thailand, 2007), а также на ежегодных итоговых научных конференциях Волгоградского НИПЧИ.

По теме диссертации опубликовано 83 научные работы. Материалы исследований использованы при написании трех монографий - «Мелиоидоз», под ред. Н.Г. Тихонова, Волгоград, 1995, «Практическое пособие для подготовки врачей-бактериологов и эпидемиологов по вопросам противодействия биотерроризму», Волгоград, 2004 и «Специфическая индикация патогенных биологических агентов. Практическое руководство», под ред. академика РАМН, Г.Г.Онищенко.- М: ЗАО «МП Гигиена».- 2006.


Структура и объем работы


Диссертация изложена в форме монографии на 268 листах машинописного текста, состоит из введения и 6 глав, включающих описание литературных данных и результаты собственных исследований, заключения и выводов. Работа иллюстрирована 21 таблицей и 61 рисунком. Список цитируемой литературы включает 386 источников, в том числе 82 отечественных и 304 иностранных работ.


СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Таксономическое положение возбудителей сапа, мелиоидоза и близкородственных микроорганизмов


Патогенные буркхольдерии по многим биологическим свойствам схожи с псевдомонадами, и, по этой причине, ранее они были объединены в семейство Pseudomonadaceae, род Pseudomonas. До этого они входили в различные роды и семейства. Так, возбудитель мелиоидоза имеет более 10 синонимов – Bacterium whitmori, Bacillus whitmori, Bacillus pseudomallei, Pfeifferella whitmori, Pfeifferella pseudomallei, Actinobacillus pseudomallei, Loefferella whitmori, Loefflerella pseudomallei, Malleomyces pseudomallei, Pseudomonas pseudomallei, Burkholderia pseudomallei.

Возбудитель сапа первое биноминальное название - Bacillus mallei получил в 1885 г. через три года после его выделения в чистой культуре F.D. Löffler и J.W. Schutz. Однако в последующие годы у этого микроорганизма, так же, как и возбудителя мелиоидоза, изменялись как таксономические позиции, так и биноминальные обозначения (Acinetobacter mallei, Loefferella mallei, Actinobacillus mallei, Malleomyces mallei, Pfeifferella mallei, Bacillus mallei, Pseudomonas mallei, Burkholderia mallei). В самостоятельный род Burkholderia возбудители сапа и мелиоидоза, наряду с другими псевдомонадами 2-группы рРНК-ДНК гомологии, выделены на основе результатов секвенирования генов 16S рРНК (Yabuuchi E. et al., 1992).

Таксономическая позиция патогенных буркхольдерий на сегодняшний день определена. Однако вопросы внутриродового разграничения буркхольдерий медицинского значения продолжают интересовать исследователей до сих пор. Род Burkholderia включает 34 описанных вида (Coenye T. et al., 2001; Coenye T., Vandamme P., 2003), девять из которых известны как бактерии комплекса Burkholderia cepacia. Схожие проблемы возникли и при установлении таксономического положения мелиоидозоподобных культур - B.thailandensis (Brett P.J. et al., 1998) и B. oklahomensis (Glass M.B. et al., 2006). Сложность определения видовой принадлежности этих микроорганизмов может приводить к ошибкам их идентификации и дифференциации от B.pseudomallei (Koh T.H. et al., 2003; Inglis T.J.J. et al., 2005). Хотя секвенирование гена 16S рРНК является определяющим геном для идентификации многих видов микроорганизмов, для рода Burkholderia имеются ограничения, обусловленные отсутствием критериев корректной дифференциации видов бактерий комплекса B.cepacia (Mahenthiralingam E. et al., 2000). Идентификация всех 9 геномоваров этого комплекса стала возможной лишь при использовании данных секвенирования другой ДНК-мишени - recA гена буркхольдерий. Однако при анализе секвенированных последовательностей и построенных на их основе филогенетических деревьев, дифференцировать возбудители сапа и мелиоидоза между собой не удалось (Payne G.W. et al., 2006).

Возбудители сапа и мелиоидоза имеют высокую степень фенотипического сходства (Anuntagool N., Sirisinha S., 2002). При изучении данных микроорганизмов методом ДНК-ДНК гибридизации в отдельных случаях степень гомологии ДНК между штаммами B.mallei и B.pseudomallei превышала внутривидовую гомологию ДНК B.pseudomallei (Rogul M. et al., 1970). О таксономической близости и идентичности рекомбинационных систем у возбудителей сапа и мелиоидоза свидетельствует и способность к взаимной трансформации на плотных средах без специальной обработки клеток для достижения компетентности (Тарасова Т.Д., Ряпис Л.А., 1983). Эти положения во многом объясняют трудности конструирования видоспецифических диагностических препаратов для возбудителя сапа.


2. Идентификация и внутривидовое типирование патогенных буркхольдерий на основе фенотипических признаков


Клиническая диагностика сапа или мелиоидоза из-за большого многообразия симптомов и быстрого течения этих заболеваний весьма затруднена (Kanai K., Deysirilert L., 1998; Dance D. A., 1991; Dance D. A., 2000; Brett P.J., Woods D.E., 2000). Полиморфизм клинических проявлений мелиоидоза настолько велик, что даже в эндемичных регионах поставить диагноз на основании клинической картины крайне проблематично. Не вызывает сомнения, что существенное увеличение числа регистрируемых в разных странах случаев сапа и мелиоидоза связано не столько с расширением ареала распространения этих инфекций в мире, сколько с хорошо налаженной в развитых странах лабораторной службой. Именно это привело к тому, что практически во всех странах Западной Европы за последние годы зарегистрированы случаи мелиоидоза среди лиц, побывавших в качестве туристов или специалистов в эндемичных зонах (Dance D. A., 2000; Cheng A. C., 2005; Frangoulidis D. et al., 2007). В нашей стране регламентированных лабораторных исследований, направленных на выявление B.pseudomallei у туристов и лиц, прибывающих из эндемичных территорий, не проводится. Не исключено, что именно по этой причине в России не зарегистрировано ни одного случая мелиоидоза. Заболеваемость сапом среди людей носит в основном спорадический характер (Цветков Н.Е., 1947). Тем не менее, периодически появляются публикации о выделении B.mallei в клинических лабораториях Италии, Испании, США. В ряде случаев это связано с внутрилабораторным заражением, что подтверждает чрезвычайную опасность работы с культурами B. mallei.

На сегодняшний день идентификация возбудителей сапа и мелиоидоза, в основном, проводится на основании фенотипических признаков. После выделения чистых культур проводят идентификацию с помощью стандартных методических приемов (Илюхин В.И. с соавт., 1983; Поповцева Л.Д. 1985; Илюхин В.И. с соавт., 1995; Inglis T.J.. et al., 2005) или полуавтоматических систем идентификации подобно API 20 NE, рекомендуемой для анализа выделенных культур (Zysk G. et al., 2000; Cheng A. C., Currie B. J., 2005).

При диагностике сапа и мелиоидоза отмечен достаточно высокий процент лабораторных ошибок идентификации возбудителей в эндемичных, а в большей степени неэндемичных регионах, в которые были завезены эти инфекции (Inglis T.J.. et al., 2005; Inglis T.J.J. et al., 2006). Сложности идентификации патогенных буркхольдерий обусловлены перекрестными реакциями с непатогенными бактериальными видами, присутствующими в нестерильных объектах за счет идентичного биохимического профиля (Inglis T.J.J., et al., 1998; Glass M.B., 2005), атипичной морфологии колоний некоторых штаммов B.pseudomallei (Howard K., Inglis T.J., 2003). Измененные биохимические свойства B.pseudomallei и B.mallei в автоматических системах идентификации приводят к ложноотрицательным результатам. (Becker K.H., 1991; Inglis T.J. et al., 1998; Srinivasan A. et al., 2001).

В своей работе мы сравнили две системы идентификации - Nefermtest 24 («Lachema», Чехия) и API – 20NE («BioMerieux», Франция) со стандартными лабораторными тестами определения видовой принадлежности B.mallei и B.pseudomallei. При анализе культур возбудителя мелиоидоза на основании таблицы дифференцирования «Указателя для анализа данных» получены идентификационные коды 1156577 и 1556577 (API 20 NE), что соответствовало литературным данным (Lowe P. et al., 2002). В системе Nefermtest 24 отмечен высокий процент ошибок идентификации штаммов. Особенно принципиальными были расхождения в оценке декарбоксилаз и денитрификации, которые являются определяющими тестами при дифференциации возбудителей сапа и мелиоидоза от B.cepacia и псевдомонад. На основании полученных данных сделано заключение, что система Nefermtest 24 существенно уступает по своей диагностической ценности API 20NE и не может быть рекомендована для идентификации патогенных буркхольдерий. С помощью обеих тест-систем нам не удалось правильно идентифицировать ни возбудитель сапа, ни B.thailandensis. Кроме того, данные системы идентификации весьма опасны с позиций соблюдения режима работы с возбудителями ООИ (СП 1.3.1285-03), ввиду возможной аэрозолизации микробной взвеси при исследовании.

Иммунодиагностические методы применяют на различных этапах лабораторной диагностики сапа и мелиоидоза и в различные сроки заболевания. Эти методы применяют и для ретроспективного серологического обследования лиц, постоянно или временно находившихся в эндемичных регионах (Ashdown L.R., 1981; Ashdown L.R. et al., 1989; Chierakul W. et al., 2005). Существующие сложности в трактовке результатов иммунодиагностических исследований могут быть связаны с регистрируемыми в ряде случаев перекрёстными реакциями, обусловленными антигенным родством патогенных буркхольдерий и гетерологичных микроорганизмов - возбудителей чумы, псевдотуберкулёза, туляремии, легионеллёза (Гонтарь И.П. с соавт., 1984; Беляков В.Д. с соавт., 1990; Пивень Н.Н., 1987; Пивень Н.Н., 1997).

Лабораторная диагностика включает не только этап идентификации возбудителей, но и определение индивидуальных особенностей штаммов, что имеет значение при определении степени сходства бактериальных культур, установлении источника инфекции при эпидемиологическом анализе и расшифровке различных вспышек инфекционных заболеваний. Внутривидовая дифференциация микроорганизмов на основе культурально-морфологичес-ких, биохимических, серологических свойств, а также вирулентности, устойчивости к антибиотикам и бактериофагам используется при паспортизации как известных, так и вновь выделяемых штаммов.

Возбудители сапа и мелиоидоза являются филогенетически тесно связанными между собой видами микроорганизмов, что подчеркивают многочисленные исследования их фенотипических свойств (Cravitz L., 1950; Howe C. et al., 1971; Илюхин В.И. с соавт., 1983; Беляков В.Д. с соавт., 1990; Kanai K., 1994; Пивень Н.Н., 1997; Anuntagool N., Sirisinha S., 2002). Наряду с этим им свойственна значительная однородность фенотипических признаков внутри вида, затрудняющая их интравидовое типирование, что и было выявлено в нашей работе.

Как показал, проведенный анализ фенотипических тестов 61 штамма B.pseudomallei и 14 штаммов B.mallei. имеющихся в коллекции ВолгоградНИПЧИ, лишь фаготипирование и анализ белкового спектра могут быть использованы для внутривидового типирования штаммов возбудителя мелиоидоза. Для штаммов возбудителя сапа эффективным методом дифференциации, основанным на анализе фенотипических свойств, является сравнительный электрофоретический анализ общеклеточных белков. Несмотря на выявление вариабельных биохимических признаков - окисление рамнозы, ксилозы, целлобиозы, реакции денитрификации, секреции клетками уреазы и гидролиз эскулина и различий в чувствительности к антибиотикам, эти тесты рекомендованы лишь в качестве дополнительных критериев дифференциации штаммов патогенных буркхольдерий, ввиду их относительно низкой внутривидовой вариабельности.

Проведенный анализ фенотипических свойств возбудителей сапа и мелиоидоза, на основе которых проводится идентификация и внутривидовое типирование B.mallei и B.pseudomallei, свидетельствует о необходимости расширения рамок лабораторных исследований и привлечения новых методических приемов для идентификации и типирования патогенных буркхольдерий, основанных на структуре их геномов.


3. Фенотипическая и генотипическая идентификация бактерий комплекса B.cepacia, B. thailandensis, B.pseudomallei-like spp.


При генодиагностике и конструировании диагностических тест-систем важное значение имеет оценка их специфичности на широком наборе близкородственных и гетерологичных микроорганизмов, с которыми необходимо провести дифференциацию. Такой набор позволяет объективно оценивать диагностические возможности вновь создаваемых систем.

В первую очередь, это касается близкородственных патогенным буркхольдериям видов B.cepacia, B.thailandensis и мелиоидозоподобных почвенных микроорганизмов (B. pseudomallei-like spp.).

B.cepacia включена в род Burkholderia в качестве типового вида (Yabuuchi E. et al., 1992). Детальный анализ биохимических свойств, белкового профиля и жирно-кислотного состава, а также ДНК-РНК и ДНК-ДНК гибридизация привели к выводу, что вид B.cepacia фактически состоит из близко связанных, но генетически отличных друг от друга 9 различных видов (или геномоваров). Эта группа бактерий стала упоминаться в литературе как B.cepacia комплекс (Coenye T. et al., 2001; Lipuma J.J. et al., 2001). Геномовары по фенотипипическим признакам схожи между собой, но генетически это отличные друг от друга группы штаммов (Coenye T. et al., 2001). При использовании биохимических и фенотипических тестов возникают трудности идентификации бактерий комплекса B.cepacia с микроорганизмами семейства β-протеобактерий, включая Pandoraea и Ralstonia (Coenye T. et al., 2001; Lipuma J.J. et al., 2001), а также достаточно часто случаются ошибки их дифференциации от B.pseudomallei (Koh T.H. et al., 2003; Inglis T.J. et al., 2005).

При уточнении видовой принадлежности 25 штаммов, выделенных из различных источников и числящихся по паспортным данным в коллекционном центре Волгоградского научно-исследовательском противочумном институте как штаммы B.cepacia, нами отобрано 18 культур, соответствующих по биохимическим свойствам, включая определение лизиндекарбоксилазы, аргининдигидролазы, ONPG виду B.cepacia. В реакции амплификации с видоспецифическими и геномоварспецифическими праймерами (Mahenthiralingam E. et al., 2000) с ДНК всех 18 штаммов нами получены положительные результаты. При ПЦР-типировании выявлено, что в коллекции Волгоградского научно-исследовательского противочумного института имеются штаммы B.cepacia принадлежащие к I (B. cepacia), II (B. multivorans), III (B. cenocepacia) и IV (B. stabilis) геномоварам.

К виду B.cepacia (геномовар I) принадлежат штаммы 25416, 3181, 3189, 610, 611, 620, 621 и 122. Причем, штамм B.cepacia 122, до наших исследований числился в коллекционном центре как атипичный невирулентный штамм B.pseudomallei Vang, так как в реакции ДНК-ДНК гибридизации не давал положительного сигнала радиоавтографа (Замараев В.С., 2004). Из исследуемых штаммов к виду B.multivorans (геномовар II) принадлежит один штамм B.cepacia 1934. Этот штамм в коллекции Института сыворотки (Дания) по фенотипическим характеристикам ранее числился как атипичный штамм B.cepacia (Bremmelgaard A., 1975). Восемь штаммов отнесены нами к виду B. cenocepacia (геномовар III) и еще один (B.cepacia 8235) к B.stabilis (геномовар IV).

Бактерии B.thailandensis генетически и иммунологически близки к возбудителю мелиоидоза. При использовании общепринятых методов идентификации данный микроорганизм практически идентичен культурам возбудителя мелиоидоза, поэтому и предложено первоначальное наименование – B.pseudomallei-like. Основное его различие с B.pseudomallei состоит в низкой вирулентности для лабораторных животных и более высокой биохимической активности по отношению к олигосахаридам из группы пентоз (Brett P.J. et al., 1997; Brett P.J. et al., 1998). После появления публикаций о регистрации B.pseudomallei в Иране (Pourtaghva M. et al., 1975), сотрудниками ВолгоградНИПЧИ в ходе экспедиционных поездок в Прикаспийскую территорию Азербайджана и Туркмении было выявлено несколько десятков культур, которые вырастали на селективных средах, предназначенных для B.pseudomallei (среда Эшдауна, среда с -аланином и др.). Изолированные штаммы агглютинировались в титрах 1:100, 1:200 мелиоидозной агглютинирующей сывороткой, но были авирулентны для золотистых хомячков. По совокупности исследуемых фенотипических признаков изучаемые почвенные микроорганизмы отнесены нами к мелиоидозоподобным штаммам (B. pseudomallei-like spp.) и получили рабочее название Ленкоранские штаммы.

Результаты, проведенного нами гибридизационного анализа коллекции микроорганизмов бактерий комплекса B.cepacia, мелиоидозоподобных штаммов и B.thailandensis, подтвердили гомологию их ДНК с B.pseudomallei. С гетерологичными микроорганизмами гомология отсутствовала (рис.1).





Рис. 1. Радиоавтограф гибридизации ДНК B.pseudomallei С-141 с ДНК штаммов B.pseudomallei-like spp. и другими гетерологичными микроорганизмами. А – радиоавтограф; Б – схема нанесения ДНК




Два сапных штамма (Олоф и Конный) в реакции ДНК-ДНК гибридизации не давали положительных сигналов радиоавтографа (Замараев В.С., 2004), при использовании биохимической системы идентификации Nefermtest 24 «Lachema» (Чехия) отнесены к виду Alcaligenes (Сенина Т.В., 2004). Полученные нами данные подтвердили результаты, на основе которых эти два штамма было решено исключить из рода Burkholderia.

Таким образом, проведенные исследования позволили подобрать адекватный набор штаммов близкородственных буркхольдерий, который был использован нами при оценке специфичности сконструированных амплификационных тест-систем, предназначенных для обнаружения B.mallei и B.pseudomallei.


4. Разработка молекулярно-генетических способов детекции патогенных буркхольдерий


Приоритет разработки амплификационной тест-системы для идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза принадлежит A.E.Lew и P.M.Desmarchelier (1994), сконструировавших специфичные олигонуклеотидные праймеры на основе гена, кодирующего синтез 23S рРНК. В последующих работах использовали ген, детерминирующий 16S рРНК (Dharakul T. et al., 1996; Brook M.D.,1997; Woo P.C. et al., 2003) и спейсерную область между этими генами (Kunakorn M., 1995). Для повышения специфичности ПЦР рекомендовали двухстадийную ПЦР (Kunakorn M. et al., 2000; Hagen R.M. et al., 2002), рестрикцию ампликонов (Sprague L.D. et al., 2002), а также различные видоспецифические последовательности (Sermswan R.W. et al., 2000; Баннов В.А., Калачёв И.Я., 2003; Smith-Vaughan H.C., Gal D., Lawrie P.M. et al., 2003; Neubauer H. et al., 2007) и SNP-маркеры (Bauernfeind A. et al., 1998; U'Ren J.M. et al., 2005; Wattiau P. et al., 2007). Однако, до сих пор нет единого мнения, коммерческих тест-систем, а также регламентирующих документов, определяющих обязательные ДНК-мишени и необходимые праймеры для идентификации патогенных буркхольдерий. В то же время, накоплен большой опыт, свидетельствующий о том, что применение какой либо одной пары праймеров при исследовании объектов внешней среды и проб клинического материала не обеспечивает достаточной эффективности анализа (Kunakorn M. et al., 2000; Sprague L.D. et al., 2002).

По этой причине для конструирования амплификационных тест-систем с целью генодиагностики сапа и мелиоидоза нами проведен анализ представленных нуклеотидных последовательностей патогенных буркхольдерий в различных генетических базах данных (ссылка скрыта), (ссылка скрыта), (ссылка скрыта), (ссылка скрыта) и выбрано семь пар праймеров на основе фрагментов гена 23S рРНК, две пары олигонуклеотидных затравок, фланкирующих участки флагеллярного гена (fliC)), и одна пара праймеров, являющихся участком гена orf13 системы III-типа секреции (TTS1).

Семь пар праймеров были общими для B.mallei и B.pseudomallei,одна пара олигонуклеотидных затравок гомологична последовательностям триады буркхольдерий - B.mallei, B.pseudomallei, B.thailandensis и две пары – B.mallei. Дополнительно в работе использована одна пары праймеров для обнаружения B.mallei, фланкирующих участок гена 23S рРНК, обозначенная М23-2/CVMP23-1 (Bauernfeind A. et al., 1998), и одна пара олигонуклеотидных затравок Bps16S-U33/Bps16S-OL731 (Dharakul T. et al., 1999), являющихся фрагментом гена 16S рРНК (табл.1).


Таблица 1

Характеристика используемых олигонуклеотидных праймеров

Праймеры	Нуклеотидные последовательности праймеров	Размер ампликона	Ожидаемая специфичность
23S рРНК
burk3s burk4as	CGAAGCTGCGGATGCGAGCTAGTCTC AGTCGCAGCCACCAGTTTATTGCAACC	615 п.н.	B.mallei B.pseudomallei
burk1s burk4as	AAGCCTGCGAAGGTGCGTTGAAAAGC CAGTCGCAGCCACCAGTTTATTGCAACC	567 п.н.	B.mallei B.pseudomallei
b23s5 b23a6	ACAAACAgTCggAgCCTCTTCg CgCTCTCCTACCATgCgAgACT	666 п.н.	B.mallei B.pseudomallei
b23s7 b23a8	GCTGCGGATGCGAGCTAGTCT CCCCCATCGCATCTAACGAC	266 п.н.	B.mallei B.pseudomallei
b23s7 burk4as	GCTGCGGATGCGAGCTAGTCT AGTCGCAGCCACCAGTTTATTGCAACC	611 п.н.	B.mallei B.pseudomallei
burk1s burk2as	AAGCCTGCGAAGGTGCGTTGAAAAGC CTTCCAATTGCTCCGCTCCCGAAGGA	351 п.н.	B.mallei
burk3s burk2as	CGAAGCTGCGGATGCGAGCTAGTCTC CTTCCAATTGCTCCGCTCCCGAAGGA	399 п.н.	B.mallei
М23-2 CVMP23-1	CACCGAAACTAGCA CACCGAAACTAGCG	526 п.н.	B.mallei
16S рРНК
Bps16S-U33 Bps16S-OL731	AAGTCGAACGGCAGCACGG TTTGCTCCCCACGCTTTCG	717 п.н.	B.mallei B.pseudomallei
fliC
bfl1s bflas2	ACGGTCTCCGTCGACCTCAC CGTTGATCTGCGCAACCATC	376 п.н.	B.mallei B.pseudomallei
burts1 burta2	ACGGCGTGTCGATCCTGCAA GCCGACCTGGAAGCTCAGCG	242 п.н.	B.mallei B.pseudomallei B.thailandensis
orf13
BTTSs1 BTTSas3	GACTGACCGCGCTCAAAGCCG TCCGGCCTGACAAACGTTTGG	162 п.н.	B.mallei B.pseudomallei