Молекулярные механизмы формирования множественной лекарственной резистентности у Burkholderia pseudomallei и близкородственных видов микроорганизмов 03. 00. 07 микробиология 03. 00. 15 генетика
| Вид материала | Автореферат |
- Л. И. Параллелизмы в молекулярной организации генома и проблемы эволюции. В кн.: Молекулярные, 251.18kb.
- Особенности эволюции морфологических и молекулярных признаков на примере близкородственных, 1418.11kb.
- Патогенетические компоненты лечения туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью, 210.94kb.
- Рабочая программа дисциплины «нормальная микрофлора человека» Код дисциплины по учебному, 110.88kb.
- 1. введение в микробиологию > 1 Предмет и задачи микробиологии. Основные свойства микроорганизмов, 1814.12kb.
- Рабочая программа дисциплины «роль микроорганизмов в жизни растений» Код дисциплины, 88.04kb.
- Рабочая программа дисциплины «экология микроорганизмов» Код дисциплины по учебному, 219.98kb.
- А. В. Низова [и др.] // Эпидемиология и инфекц болезни. 2007. N c. 7-11, 85.01kb.
- Рабочая программа дисциплины «жизнь микроорганизмов в экстремальных условиях» Код дисциплины, 123.41kb.
- Лекция 1 Введение. Основные принципы классификации микроорганизмов. Различия архебактерий,, 46.21kb.
На правах рукописи
Викторов Дмитрий Викторович
Молекулярные механизмы формирования множественной лекарственной резистентности у Burkholderia pseudomallei и близкородственных видов микроорганизмов
03.00.07 – микробиология
03.00.15 – генетика
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Волгоград – 2009
Работа выполнена в ФГУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Научные консультанты:
доктор медицинских наук, профессор
Алексеев Владимир Валерьевич
доктор медицинских наук, профессор
Меринова Людмила Константиновна
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор
Щербаков Анатолий Анисимович
доктор биологических наук, старший научный сотрудник
Антонюк Людмила Петровна
доктор медицинских наук, профессор
Шемякин Игорь Георгиевич
Ведущая организация:
ФГУ «48 Центральный научно-исследовательский институт Минобороны России»
Защита состоится «___»___________2009 г. в ___ часов на заседании диссертационного совета Д.208.078.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46).
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»
Автореферат разослан «___»____________2009 г.
Учёный секретарь диссертационного совета
доктор биологических наук,
старший научный сотрудник Слудский А.А.
Общая характеристика работы
Актуальность работы. Характерным и важным биологическим свойством патогенных буркхольдерий и близких им микроорганизмов является высокая природная резистентность к широкому спектру антимикробных соединений. Наличие этого свойства создает значительные трудности для успешного лечения вызываемых ими заболеваний. Необходимо отметить, что биологические основы полирезистентности у большинства видов Burkholderia на сегодняшний день являются мало исследованными.
К настоящему времени накоплен довольно обширный материал об индивидуальной устойчивости различных видов буркхольдерий к антибактериальным агентам (Антонов и др., 1991; Desai et al., 1998; Kenny et al., 1999; Vorachit et al., 2000; Moore et al., 2001; Jenney et al., 2001; Nzula et al., 2002). Показано, что с одной стороны, препараты тетрациклинового, фторхинолонового, цефалоспоринового, карбапенемового рядов и некоторые другие соединения в опытах in vitro проявляют выраженное ингибирующее действие на клетки патогенных и условно-патогенных видов данной группы микроорганизмов, культивируемых на искусственных питательных средах, с другой - применение этих антибактериальных агентов в условиях персистенции бактерий в организме-хозяине нередко оказывается малоэффективным (Haussler et al., 1999; Inglis et al., 2004; Azizi et al., 2005). Кроме того, известно, что буркхольдерии как при культивировании на питательных средах в селективных условиях, так и в процессе лечения быстро приобретают резистентность к различным антибактериальным препаратам, и нередко резистентность носит множественный характер (Rajyaguru, Muszynski, 1997; Ho et al., 2002). Сложность генетической организации (Cheng, Lessie, 1994; Rodley et al., 1995; Songsivilai, Dharakul, 2000; Nierman et al., 2004; Holden et al., 2004) позволяет говорить о высокой адаптивной «емкости» их геномов и предполагать наличие различных молекулярно-генетических механизмов, посредством которых реализуется множественная лекарственная резистентность. Последнее является основанием к тому, чтобы обозначает в качестве одного из приоритетных направлений в исследовании микроорганизмов рода Burkholderia изучение фундаментальных основ их устойчивости к антибактериальным агентам, в первую очередь, касающихся молекулярно-генетических механизмов формирования резистентности.
Развитие исследований в этом направлении будет способствовать пониманию основных генетических особенностей буркхольдерий, предопределяющих их повышенную метаболическую пластичность, приспособляемость к воздействию специфических и неспецифических ингибиторов и защитных факторов макроорганизма. Следует отметить, что знание молекулярных механизмов развития резистентности к антимикробным соединениям имеет не только фундаментальное значение. Речь идет также о возможности получения важных с точки зрения современной теоретической и практической медицины фактов, которые могут быть положены в основу новых подходов к антибиотикотерапии инфекций, вызываемых микроорганизмами рода Burkholderia.
На сегодняшний день довольно детально изучены некоторые из молекулярно-генетических механизмов множественной лекарственной резистентности бактерий: аккумуляция и стабильное наследование отдельных R-детерминант генных кассет в составе интегронов (Ильина, 2003; Fluit, Schmitz, 2004), активный энергозависимый выброс антимикробных соединений из бактериальных клеток (multidrug efflux) (Putman et al., 2000; Poole 2001; Paulsen, Lewis 2001), снижение общей проницаемости клеточной оболочки за счет изменения экспрессии поринов наружной мембраны (Poole, 2002). В рассматриваемом аспекте патогенные и филогенетически близкие им Burkholderia представляют собой весьма интересные объекты исследований, позволяющие анализировать особенности молекулярных механизмов, определяющих тот или иной тип устойчивости к ингибиторам, у близкородственных видов, эволюционирующих в различных экологических нишах.
Возможности современного изучения лекарственной резистентности определяются наличием молекулярно-биологических методов и модельных систем, позволяющих идентифицировать и осуществлять анализ последовательностей генома, детерминирующих резистентность. Необходимыми элементами здесь являются специальные штаммы, несущие генетические детерминанты измененной чувствительности, а также методы молекулярного анализа R-детерминант – элементов транспортных систем клеток, ферментов инактивации/модификации, генов внутриклеточных мишеней действия антибиотиков и других. Клонирование генетических последовательностей буркхольдерий, определяющих различные спектры лекарственной резистентности, анализ их экспрессии в гетерологичных видах, а также разработка подходов, направленных на идентификацию дифференциально экспрессирующихся последовательностей генома в различных физиологических состояниях микроорганизма (Rivera-Marrero et al., 1998; Fleming et al., 1998; Benson et al., 2000), также входят в спектр необходимых методологических приемов при изучении генетических механизмов множественной лекарственной резистентности патогенных буркхольдерий и идентификации последовательностей геномов, маркирующих тот или иной спектр лекарственной резистентности.
Настоящая диссертация содержит обобщенные материалы исследований в этих направлениях, выполненных в лаборатории функциональной геномики ФГУЗ ВолгоградНИПЧИ в рамках государственных НИР и исследовательских проектов, поддержанных грантами РФФИ 07-04-01568 и 07-04-08660. Результаты, отраженные в диссертации, получены как лично соискателем, так и в соавторстве с сотрудниками лаборатории, работавшими под его руководством, а также с сотрудниками лабораторий генетики и молекулярной биологии ФГУЗ ВолгоградНИПЧИ.
Цель настоящей работы заключалась в комплексном изучении основных закономерностей формирования множественной устойчивости к антибактериальным препаратам у буркхольдерий группы «pseudomallei» (B. pseudomallei, B. mallei, B. thailandensis), идентификации и анализе ведущих молекулярных механизмов, ответственных за развитие полирезистентности.
Задачи исследования:
- Создать коллекцию изогенных штаммов B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis, отличающихся по спектру устойчивости и инсерционных мутантов со сниженным уровнем резистентности для использования в качестве моделей для изучения множественной лекарственной резистентности.
- Изучить динамику формирования и стабильность наследования различных типов антибиотикорезистентности у B. pseudomallei и близкородственных видов. Исследовать у мутантных штаммов спектры перекрестной устойчивости к антимикробным препаратам различных классов.
- Выявить закономерности развития множественной резистентности Burkholderia к антибиотикам на уровне транспортных мембранных систем, идентифицировать и охарактеризовать мембранные протеины, участвующие в формировании тех или иных типов устойчивости.
- Разработать методические основы изучения транскрипционных профилей буркхольдерий и провести сравнительный анализ дифференциально экспрессирующихся последовательностей эффлюкс-детерминант различных типов при развитии множественной антибиотикоустойчивости у B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis.
- Клонировать в E. coli последовательности генома B. pseudomallei, кодирующие компоненты мембранных транспортных систем активного энергозависимого выброса антимикробных соединений из клеток и провести анализ их экспрессии в гетерологичной системе.
- Исследовать геномный полиморфизм и вариации в структуре детерминант мишеней действия лекарственных препаратов при формировании резистентности к антибиотикам множественного характера, провести первичный структурный анализ элементов генома, способных к включению в свой состав генов антибиоткорезистентности, оценить перспективы молекулярного маркирования различных фенотипов антибиотикорезистентности у бактерий группы «pseudomallei».
Научная новизна
В настоящей работе на основе полученной коллекции мутантных полирезистентных штаммов с различными спектрами лекарственной устойчивости и мутантов со сниженным уровнем резистентности впервые проведено изучение особенностей формирования устойчивости множественного типа к антибиотикам у B. pseudomallei и родственных ей видов B. mallei и B. thailandensis.
Впервые изучены закономерности формирования и наследования резистентности к антибиотикам классов цефалоспоринов и фторхинолонов у B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis с последующим развитием у них множественной устойчивости к препаратам ряда аминогликозидов, β-лактамов и хлорамфеникола. Показано, что устойчивость к антимикробным препаратам различных классов у В. pseudomallei, B. mallei и В. thailandensis обусловлена как возрастанием экспрессии аппарата активного выброса антибиотиков (multidrug efflux), так и снижением проницаемости клеточной оболочки за счет утраты либо пониженной экспрессии отдельных поринов.
Изучены основные механизмы формирования резистентности Burkholderia к антибиотикам, реализующиеся на уровне транспортных мембранных систем; впервые продемонстрирована роль в развитии множественной резистентности транспортного типа мембранных белков 110, 71, 48, 39, 27 и 21 kDa. Разработана технология выделения и очистки порообразующих мембранных белков B. pseudomallei и получен патент на изобретение № 2208445 «Способ выделения белка 39 кДа наружной мембраны возбудителя мелиоидоза» (зарегистрирован в Государственном реестре изобретений РФ 20.07.2003).
Исследовано соотношение изменения проницаемости клеточных мембран и активного энергозависимого транспорта лекарственных препаратов при развитии множественной резистентности у возбудителя мелиоидоза. У полирезистентных мутантов B. pseudomallei выявлено существенное снижение мембранной проницаемости для ряда соединений различной химической природы и физико-химических свойств – жирных кислот, солей желчных кислот, анионных и неионных детергентов, красителей. В экспериментах по оценке влияния соединения, блокирующего мембранные транспортеры, показана важная роль процессов энергозависимого выброса антимикробных соединений при формировании у B. pseudomallei резистентности множественного характера.
Охарактеризованы изменения биохимической активности, вирулентности и продукции поверхностных и внеклеточных биополимеров, имеющих значение факторов патогенности, в связи с развитием у B. pseudomallei полирезистентности. Показано, что приобретение фенотипа множественной резистентности к антибиотикам сопровождается существенной функциональной модификацией секреторных систем клеток возбудителя, выражающейся в структурных модификациях ЛПС, изменениях способности микроорганизма к секреции экзополисахарида и комплекса внеклеточных ферментов. Приоритетность исследований поверхностных и секреторных биополимеров B. pseudomallei, имеющих значение факторов патогенности, подтверждена патентами № 96111507 «Способ получения протективного гликопротеина возбудителя мелиоидоза» (зарегистрирован Российским агентством по патентам и товарным знакам 27.04.1998), № 2231364 «Способ получения капсульного вещества возбудителя мелиоидоза» (зарегистрирован в Государственном реестре изобретений РФ 27.06.2004), № 2255762 «Способ получения капсульного антигена возбудителя мелиоидоза, обладающего антифагоцитарной активностью» (зарегистрирован в Государственном реестре изобретений РФ 10.07.2005).
Впервые на основе известных последовательностей геномов буркхольдерий проведен сравнительный анализ in silico нуклеотидных последовательностей идентифицированных и предполагаемых генов лекарственного эффлюкса B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis; обозначены группы детерминант множественной антибиотикорезистентности и подобраны олигонуклеотидные праймеры для амплификации консервативных фрагментов генов лекарственных транспортеров MFS (QacA/EmrB), SMR (QacE) и RND (AcrB/AcrD/AcrF) типов.
Осуществлена разработка методических подходов к изучению транскрипционных профилей исследуемых видов Burkholderia методом дифференциального дисплея мРНК с использованием генспецифических праймеров и проведено сравнительное исследование дифференциально экспрессирующихся генов эффлюкс-протеинов различных функциональных семейств у исходных штаммов и полирезистентных мутантов буркхольдерий, культивируемых в неселектвных условиях и при воздействии антибиотиков групп фторхинолонов и цефалоспоринов. Впервые показано сочетанное участие AcrB/AcrD/AcrF, QacA/EmrB и QacE детерминант в формировании антибиотикорезистентности множественного типа у видов группы «pseudomallei» и выявлен повышенный конститутивный уровень экспрессии QacA/EmrE и AcrB/AcrD/AcrF эффлюкс-транспортеров у части полирезистентных мутантов.
Впервые в Escherichia coli клонированы последовательности хромосомной ДНК полирезистентного мутанта B. pseudomallei 56770 SMCP, несущие детерминанты AcrB/AcrD/AcrF и QacE эффлюкс-транспортеров и показано, что их экспрессия приводит к развитию резистентности рекомбинантных клонов к препаратам фторхинолоновой и аминогликозидной групп. Рекомбинантный штамм E. coli ZV1 (KM167), несущий клонированные последовательности эффлюкс-систем B. pseudomallei, защищен патентом на изобретение № 2280688 «Рекомбинантный штамм Escherichia coli ZV1 – носитель клонированной последовательности ДНК Burkholderia pseudomallei, детерминирующей синтез белка 32 kDa и резистентность к пефлоксацину и стрептомицину» (зарегистрирован в Государственном реестре изобретений РФ 27.07.2006).
Впервые исследованы генетические вариации структуры (аллельного полиморфизма) гена ДНК-гиразы А у мутантных штаммов буркхольдерий с различными спектрами устойчивости к антибиотикам. Показано, что полирезистентные мутанты B. pseudomallei и B. mallei с высоким уровнем устойчивости к антибиотикам фторхинолонового ряда несут точечные мутации в регионе гена ДНК-гиразы А, детерминирующем резистентность к фторхинолоновым соединениям (QRDR), приводящие к нескольким типам аминокислотных замен в последовательности белка (Thr83Ile, Gly81Cys и Asp87Tyr). Секвенированные нуклеотидные последовательности QRDR диких и мутантных штаммов B. pseudomallei и B. mallei депонированы в Genbank NCBI (access. EU541544, EU541545, EU541546, EU541547, EU541548, EU541549, published 29.03.2008).
C использованием ПЦР-анализа и секвенирования установлено, что геномы исследуемых штаммов B. pseudomallei и B. thailandensis несут последовательности, структурно сходные с интегронами - генетическими элементами, способными включать в свой состав индивидуальные генные кассеты по механизму сайт-специфической рекомбинации. Анализ геномных регионов буркхольдерий, имеющих максимальные показатели сходства с секвенированными ампликонами, продемонстрировал наличие структур, включающих ген транспозазы/интегразы и кодирующие последовательности, аннотированные как детерминанты лекарственной устойчивости - гены эффлюкс-транспортеров MFS и RND типов. Секвенированные нуклеотидные последовательности фрагментов обнаруженных структур депонированы в Genbank NCBI (access. AY772715, published 7.11.2004).
Впервые апробированы техники молекулярного типирования, основанные на амплификации полиморфных ДНК и фрагментов генома, содержащих гены интегразы, для анализа геномного полиморфизма штаммов B. pseudomallei дикого типа, селекционированных вариантов, высокорезистентных к цефтазидиму, пефлоксацину и офлоксацину, и транспозонных мутантов, характеризующихся сниженной устойчивостью к отдельным классам антимикробных соединений. Полученные результаты указывают на заметные геномные перестройки при развитии различных типов резистентности у B. pseudomallei и близкородственных бактерий, и демонстрируют возможность определения дополнительных молекулярных маркеров, ассоциированных с различными типами лекарственной резистентности у патогенных буркхольдерий.
При выполнении исследования разработана электронная библиографическая компьютерная база данных рег. № 2006620082 «Потенциальные агенты биотерроризма: возбудители особо опасных инфекций и биологические токсины», зарегистрированная в Государственном реестре баз данных Российской Федерации в 2006 г.
Разработанные в ходе выполнения работы методологические подходы легли в основу исследовательских проектов 07-04-01568 и 07-04-08660,получивших финансовую поддержку Российского фонда фундаментальных исследований.
Практическая ценность
Создана коллекция, представленная 14 мутантными штаммами B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis с различными спектрами множественной лекарственной устойчивости и 10 инсерционными мутантами, недостаточными по продукции отдельных мембранных белков и имеющими сниженный уровень резистентности к препаратам классов фторхинолонов и цефалоспоринов. Полученный набор штаммов предназначен для изучения молекулярных механизмов формирования лекарственной резистентности и структурно-функционального анализа поверхностных биополимеров патогенных буркхольдерий. Отдельные полирезистентные варианты и инсерционные мутанты со сниженным уровнем устойчивости депонированы в Государственной Коллекции Патогенных Бактерий РосНИПЧИ «Микроб» (ГКПБ «М»).
Получены рекомбинантные штаммы E. coli, несущие клонированные последовательности хромосомной ДНК B. pseudomallei - детерминанты резистентности транспортного типа к соединениям фторхинолоновой и аминогликозидной групп, предназначенные для структурно-функционального анализа эффлюкс-систем возбудителя мелиоидоза. Рекомбинантный штамм E. coli ZV1 (KM167) депонирован в Государственной Коллекции Патогенных Бактерий (ГКПБ «М») РосНИПЧИ «Микроб».
В ходе анализа адаптивных модификаций поверхностных и секреторных систем клеток возбудителя мелиоидоза разработаны технологические приемы очистки, идентификации и детекции поверхностных и секреторных биополимеров B. pseudomallei, имеющих значение основных факторов патогенности микроба. По результатам исследований составлены методические рекомендации «Оценка иммунотропных и иммуногенных свойств поверхностных антигенов Burkholderia pseudomallei» (утверждены директором ВолгНИПЧИ 29.12.1998), методические рекомендации «Выделение, очистка и изучение некоторых иммунобиологических свойств белков клеточных мембран возбудителя мелиоидоза» (утверждены директором ВолгНИПЧИ 28.02.2001).
Предложен набор из 11 олигонуклеотидных праймеров, специфичных последовательностям сайтов связывания с рибосомой мРНК и консервативным фрагментам генов лекарственного эффлюкса буркхольдерий и осуществлена разработка способов анализа транскрипционных профилей патогенных Burkholderia в RT-PCR для выявления дифференциально экспрессирующихся последовательностей геномов при формировании различных фенотипов лекарственной устойчивости у B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis.
Подобраны праймеры для амплификации участка гена ДНК-гиразы А буркхольдерий, включающего регион, детерминирующий устойчивость к хинолонам. Осуществлена разработка техники анализа аллельного полиморфизма gyrA, включающая этапы амплификации QRDR, анализа конформационного полиморфизма однонитевых цепей ампликонов (SSCP) и отбора вариантов с атипичными SSCP-профилями, секвенирования «кандидатных» мутантных последовательностей и определения характера и типа мутаций.
Результаты исследований, проведенных в рамках настоящей работы, вошли в материалы руководств «Практическое пособие для подготовки врачей-бактериологов и эпидемиологов по вопросам противодействия биотерроризму» (Волгоград, 2004), «Опасные инфекционные заболевания. Учебное пособие» (Волгоград, 2006), «Методическое пособие для проведения практических занятий по лабораторной диагностике мелиоидоза с использованием штамма-имитатора Burkholderia thailandensis KM-161» (утверждены Главным государственным санитарным врачом РФ Г.Г. Онищенко 16.07.2008).
Материалы диссертации используются при проведении лекционных и практических занятий в ВолгоградНИПЧИ в рамках учебных программ по первичной специализации и усовершенствованию специалистов: «Программы курсов повышения квалификации бактериологов и эпидемиологов по противодействию биотерроризму» (утверждена Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г. Г. Онищенко 01.02.2001), «Программы курсов повышения квалификации врачей-бактериологов общей медицинской сети, центров госсанэпиднадзора и противочумных учреждений по специфической индикации и лабораторной диагностике особо опасных инфекций, санитарной охране территории и противоэпидемической защите населения» (утверждена Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г. Г. Онищенко 28.09.1999), а также при чтении лекций и проведении практических занятий учебных курсов «Молекулярная биология» и «Современные аспекты генодиагностики и биотехнологии» кафедры молекулярной биологии и генетики медико-биологического факультета Волгоградского государственного медицинского университета.