Молекулярные механизмы формирования множественной лекарственной резистентности у Burkholderia pseudomallei и близкородственных видов микроорганизмов 03. 00. 07 микробиология 03. 00. 15 генетика

Вид материала

Эффлюкс-системы и развитие множественной антибиотикорезистентности Burkholderia
B. pseudomallei
B. pseudomallei, B. mallei
B. pseudomallei, B. mallei
B. pseudomallei, B. mallei
B. pseudomallei
B. pseudomallei, B. mallei
B. pseudomallei
B. pseudomallei

Подобный материал:

1 2 3 4 5

Эффлюкс-системы и развитие множественной антибиотикорезистентности Burkholderia

Системы лекарственного эффлюкса патогенных Burkholderia. В последнее время у грамотрицательных и грамположительных бактерий интенсивно изучается один из механизмов множественной лекарственной устойчивости, представленный системами активного энергозависимого транспорта и выброса антимикробных соединений из клеток во внешнюю среду (multidrug efflux) (Ma et al., 1994; Nikaido, 1994; Nikaido et al., 1998; Kohler et al., 1999; Van et al., 2000; Borges-Walmsley, Walmsley, 2001; Markham, Neyfakh, 2001; Poole, 2001; Poole, 2004; Saidijam et al., 2006). Большинство из выявленных транспортных систем резистентности специфичны для довольно узкого ряда структурно сходных субстратов, однако идентифицированы и мультиэкспортеры (multidrug efflux pumps), «оперирующие» с широким набором даже структурно различных антибиотических соединений (Nikaido, 1998; Zgurskaya, Nikaido, 2000). Известные на сегодня бактериальные лекарственные мультитранспортеры принадлежат к 6 различным функциональным семействам транспортных протеинов: ABC (ATP binding cassette), MFS (Major Facilitator Superfamily), RND (Resistance / Nodulation / Division), SMR (Small Multidrug Resistance), MATE (Multidrug and Toxic Compound Extrusion), MET (Multidrug Endosomal Transporter) (Paulsen et al., 2001).

Мы использовали технику дифференциального дисплея мРНК для исследования экспрессии последовательностей геномов, гомологичных некоторым известным на сегодняшний день efflux-детерминантам MFS, SMR и RND семейств транспортных протеинов, у исходных и мутантных штаммов B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis в процессе селективного воздействия антимикробными препаратами фторхинолоновой и цефалоспориновой групп. Первичным этапом этого раздела исследований был сравнительный анализ in silico нуклеотидных последовательностей известных и предполагаемых генов лекарственного эффлюкса B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis, выполненный с использованием биоинформационного программного обеспечения на основе опубликованных в Genbank последовательностей геномов буркхольдерий группы «pseudomallei».

Исследование представленных в Genbank геномных сиквенсов штаммов B. pseudomallei K96243, B. pseudomallei 1710b, B. mallei ATCC23344 и B. thailandensis E264 показали наличие большого числа кодирующих последовательностей, гомологичных детерминантам лекарственных транспортеров MFS типа. Группирование кодируемых обозначенными генами протеинов по числу точных соответствий в участках их аминокислотных последовательностей с использованием алгоритма Clustal W (Thompson et al., 1994) и оценка их гомологии известным MFS-протеинам показала, что около половины MFS эффлюкс-транспортеров B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis принадлежит к DHA2 (Drug/Hydrogen Antiport) семейству вторичных транспортеров, при этом большая часть из них высокогомологична лекарственным мультитранспортерам QacA/EmrB субсемейства, а небольшую группу составляют гомологи Bcr/CflA субсемейства (рис. 9).

Принадлежащие к данным группам транспортные белки различных бактериальных видов, как сообщалось, осуществляют энергозависимый выброс структурно разнородных антимикробных соединений из клеток во внешнюю среду (Putman et al., 2000; Saidijam et al., 2006).

Несомненный интерес представляет также характер локализации детерминант MFS-транспортеров в геномах B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis. Кодирующие последовательности MFS-протеинов расположены в области генных кластеров тРНК, транскрипционных регуляторов систем транспорта компонентов полисахарида, флагеллярных генов, генов консервативного метаболизма, генных кластеров секреторных систем II и III типов. Отметим также наличие последовательностей IS-элементов и генов транспозаз в непосредственной близости от локусов многих MFS-транспортеров, что позволяет предполагать важную роль транспозиционных событий в формировании этих фрагментов геномов.

Рис. 9. ClustalW дендрограмма соответствия аминокислотных последовательностей MFS-транспортеров B. pseudomallei K96243, B. pseudomallei 1710b, B. mallei ATCC23344 и B. thailandensis E264. Указано количество TMS белков и их принадлежность к отдельным семействам и субсемействам MFS.

Последовательности геномов B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis, гомологичные SMR транспортерам EmrE/QacE группы, как показал проведенный анализ, расположены на хромосоме 1 у всех трех видов буркхольдерий и локализованы в области генных кластеров, кодирующих компоненты консервативных метаболических путей и АТФ-зависимых секреторных систем. Сравнение аминокислотных последовательностей EmrE микроорганизмов группы «pseudomallei», других буркхольдерий и видов отдаленой гетерологии продемонстрировало полную идентичность этих протеинов у B. pseudomallei и B. mallei и отличия от них по 9 аминокислотам у соответствующего белка B. thailandensis. Оказалось также, что белок EmrE B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis структурно более сходен c SMR-транспортерами B. phymatum, B. phytofirmans, B. xenovorans, видов Ralstonia, Serracia и Klebsiella, чем с EmrE B. cenocepacia и некоторых других видов буркхольдерий (рис. 10).

Рис. 10. Аминокислотные последовательности EmrE различных видов Burkholderia и гетерологичных микроорганизмов. Оттенками выделены фрагменты с различной степенью идентичности аминокислотных последовательностей.

В отношении эффлюкс-детерминант, кодирующих транспортеры RND суперсемейства, анализ геномных сиквенсов B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis показал, что большинство из трехкомпонентных RND эффлюкс-систем у данных видов буркхольдерий локализовано на хромосоме 1 в областях генных кластеров транспортных систем аминокислот и азотистых оснований, генов синтеза и транспорта фимбриальных структур, систем секреции сидерофоров и гемолизинов (гомологов HlyB-HlyD), генов пуринового и липидного обмена, генов контроля клеточного цикла. В большинстве случаев, последовательности RND эффлюкс-систем представлены оперонами, состоящими из дивергентно транскрибируемого гена транскрипционного регулятора, гена вспомогательного белка MFP семейства, гена транспортера и гена порина наружной мембраны.

Проведенный анализ гомологии аминокислотных последовательностей обозначенных RND транспортеров буркхольдерий и протеинов - представителей различных групп RND суперсемейства (рис. 11) показал прнадлежность большинства предполагаемых эффлюкс-белков данной категории к HAE1 (Hydrophobe/amphiphile efflux-1) семейству транспортеров и максимальную степень сходства с лекарственными мультиэкспортерами AcrB/AcrD/AcrF и YegO/YegN типов (Tseng et al., 1999).

Рис. 11. Clustal W дендрограмма гомологии аминокислотных последовательностей RND-транспортеров B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis и эффлюкс-протеинов различных семейств суперсемейства RND.

In silico исследование предполагаемых детерминант антибиотикорезистентности транспортного типа B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis с использованием биоинформационных технологий продемонстрировало разнообразие генетических механизмов, посредством которых у них может реализовываться множественная устойчивость к антимикробным соединениям, а обозначенные по результатам анализа группы детерминант множественной резистентности были использованы при подборе олигонуклеотидных праймеров для детекции генов лекарственного эффлюкса в ПЦР и изучении их экспрессии в неселективных условиях и при воздействии антибиотиков.

Набор праймеров для амплификации последовательностей эффлюкс-детерминант включал олигонуклеотиды, специфичные консервативным фрагментам CDS транспортеров MFS (QacA/EmrB группа гомологии), SMR (QacE) и RND (AcrB/AcrD/AcrF группа) типов (таб. 4). В последнем случае были использованы три пары праймеров для детекции участков кодирующих последовательностей, гомологичных идентифицированным ранее генам эффлюкс-транспортеров B. pseudomallei AmrB (Moore et al., 1999) и BpeB (Chan et al., 2004a), а также предполагаемых RND эффлюкс-транспортеров (BPSS1119/BMAA1045), структурно сходных с MexF P. aeruginosa (Kohler et al., 1997).

Табл. 4.

Характеристика олигонуклеотидных праймеров, использованных для анализа дифференциальной экспрессии генов лекарственного эффлюкса Burkholderia

Праймер	Последовательность (5’-3’)	Т отжига, ºC	Мишени	ПЦР- фрагмент	Ампликон (пн)
AcrB/AcrD/AcrF эффлюкс-транспортеры
mxBs	GATCTCCGCGCAGAACGT	57	BPSL0815 (bpeB) BMA0316	618 - 1211	594
mxBas	AGGCCGATCGCGAGCACG
mxYs	TTCATGCAGAACTTCCGC	57	BPSL1803 (amrB)	1069 - 1371	303
mxYas	GAACGCCATCGGCACGAA
mxFs	CGTCGTGATTTTCCTGTT	55	BPSS1119 BMAA1045 BTH_I2867	1026 - 1381 1080 - 1435 1050 - 1380	356
mxFas	ACGCGAACTCCTTGAACA
QacA/EmrB эффлюкс-транспортеры
qcAs	GACAACTTCTCGTGGCCGTG	62	BMA_1058 BMA_A0922 BURPS1710b_A2077 BTH_I2561 BTH_II1077	507 - 935	449
qcAas	GACGCCATCACCAGCCCCGC
SMR (QacE) эффлюкс-транспортеры
qcEs	ATGCAACTTCCAGGTTACGC	59	BMA1245 BPSL1861 BURPS1710b_1984	1 - 339	339
qcEas	TCAATGCGCCTGCATTTTCG

Дифференциальная экспрессия эффлюкс-детерминант при формировании множественной резистентности Burkholderia. Участие эффлюкс-транспортеров AcrB/AcrD/AcrF, QacA/EmrB и QacE групп в формировании антибиотикорезистентности множественного типа оценивали по результатам RT-PCR анализа мРНК транспортеров у исходных штаммов и полирезистентных мутантов, культивируемых в неселектвных условиях и на средах с субъингибирующими концентрациями антибиотиков фторхинолонового и цефалоспоринового рядов (рис. 12).

В неселективных условиях исходные штаммы и большинство резистентных мутантов имели невысокий уровень конститутивной экспрессии AcrB/AcrD/AcrF транспортеров AmrB и BpeB, за исключением двух мутантов B. pseudomallei Ofx^R Caz^R и Caz^R Pfx^R фенотипов, у которых уровень экспрессии AmrB был существенно выше. Экспрессия BPSS1119/BMAA1045 в неселективных условиях была отмечена только у Caz^R Pfx^R мутанта B. pseudomallei. Рост в присутствии антибиотиков вызывал заметное возрастания количества мРНК BpeB, AmrB и BPSS1119/BMAA1045 и у диких, и у мутантных штаммов, при этом все же более выраженное возрастание экспрессии RND эффлюкс-детерминант наблюдалось у полирезистентных производных.

Уровень экспрессии эффлюкс-транспортеров QacA/EmrB был приблизительно одинаковым у исходных и мутантных штаммов при росте на средах, не содержащих антимикробных соединений; заметное увеличение мРНК данных эффлюкс-генов мы наблюдали у мутантных штаммов буркхольдерий с высоким уровнем устойчивости к препаратам фторхинолоновой группы при культивировании на средах с пефлоксацином. Уровень мРНК QacE также оказался приблизительно одинаковым у большинства штаммов буркхольдерий, выращенных на неселективных средах. В селективных условиях мы отмечали увеличение экспрессии QacE, более выраженное у мутантных штаммов B. pseudomallei и B. thailandensis.

Рис. 12. RT-PCR анализ экспрессии эффлюкс-генов у исходных штаммов и полирезистентных мутантов буркхольдерий, выращенных в неселективных (A) и селективных (B) условиях. Треки 1 – 10: B. pseudomallei 56770, B. pseudomallei 56770 SMPC, B. pseudomallei 56770 SMCP, B. pseudomallei 56770 SMOC, B. mallei C-5, B. mallei C-5 SMP-150-2, B. mallei C-5 SMP-150-3, B. mallei C-5 SMC, B. thailandensis E264, и B. thailandensis E264 SMPC. Трек C: контроль, транскрипт gyrA.

Полученные результаты, таким образом, указывают на участие эффлюкс-систем различных типов в реализации множественной устойчивости буркхольдерий группы «pseudomallei» к антибиотикам фторхинолонового ряда, цефалоспоринам и другим антимикробным соединениям. Отметим, что факты сочетанного действия эффлюкс-систем различных типов при развитии множественной устойчивости известны для ряда бактериальных видов, в том числе природнорезистентных (Germ et al., 1999; Lee et al., 2000). Повышенный уровень экспрессии гомологов QacA/EmrE и AcrB/AcrD/AcrF в отсутствии селективного воздействия, наблюдаемый нами у части мутантов, возможно, свидетельствует о генетически закрепленных нарушениях механизмов регуляции последовательностей, что, например, было показано в отношении гиперэкспрессии эффлюкс-оперона mexAB-oprM P. aeruginosa (Adewoye et al., 2002).

Экспрессия эффлюкс-последовательностей B. pseudomallei в гетерологичных системах. Еще одно подтверждение участия QacE и AcrB/AcrD/AcrF эффлюкс-систем B. pseudomallei в формировании устойчивости к антимикробным соединениям различных групп было получено в экспериментах по shotgun-клонированию в составе вектора pUC19 ДНК Caz^R Pfx^R мутанта B. pseudomallei. В качестве источника хромосомной ДНК был использован штамм B. pseudomallei 56770 SMCP, имеющий высокий уровень резистентности к цефалоспоринам, фторхинолонам, аминогликозидам и некоторым -лактамам, и отличающийся стабильным сохранением маркеров резистентности при длительном культивировании в неселективных условиях. Полученные рекомбинантные штаммы E. coli характеризовались резистентностью к пефлоксацину, имипенему и аминогликозидам (таб. 5).

Табл. 5.

Рекомбинантные штаммы E. coli

Штамм	Фенотип резистентности
E. coli JM107 (pLKp1)	Pfx^RStr^R
E. coli JM107 (pJla1)	Pfx^RStr^R
E. coli JM107 (pJla3)	Pfx^RStr^R
E. coli JM107 (pLKp3)	Pfx^RStr^RKan^R
E. coli DH1 (pLKp2)	Pfx^RStr^R
E. coli DH1 (pLKp4)	Pfx^R Imp^R
E. coli DH1 (pDla3)	Pfx^RStr^R Imp^R

Анализ спектра резистентности полученных рекомбинантных штаммов к антимикробным соединениям различных классов и снижение уровня их устойчивости в присутствии соединений – блокаторов мембранных каналов (верапамил) (рис. 13) указывали на ведущую роль механизмов лекарственного эффлюкса в формировании наблюдаемых фенотипов антибиотикорезистентности.

Рис. 13. Устойчивость рекомбинантного штамма E. coli DH1 LKp4 к пефлоксацину при воздействии блокатора мембранных каналов. Прерывистой линией показана выживаемость микробных клеток в присутствии верапамила (40 мкг/мл)

Продукты экспрессии клонированных последовательностей хромосомной ДНК B. pseudomallei - белки 32 и 48 kDa - были идентифицированы в иммуноблоттинге с иммуноглобулинами к общеклеточным антигенам B. pseudomallei (рис. 14).

Рис. 14. Иммуноблоттинг общеклеточных (A) и мембранных белков (B) полирезистентных мутантов B. pseudomallei и рекомбинантных штаммов E. coli.

Учитывая тот факт, что штамм B. pseudomallei 56770 SMCP отличается возрастанием уровня экспрессии эффлюкс-детерминант AcrB/AcrD/AcrF, QacA/EmrB и QacE типов, было проведено исследование экспрессии этих последовательностей у отобранных в результате скрининга рекомбинантных клонов методом дифференциального дисплея мРНК с ген-специфичными праймерами (рис. 15).

A

Рис.15. Детекция мРНК эффлюкс-последовательностей B. pseudomallei amrB (A) и emrE (B) в рекомбинантных штаммах E. coli. Обозначения: М – маркерная ДНК (517, 460, 396, 350 п.н.); 1 – E. coli JM107 LKp1; 2 – E. coli DH1 LKp2; 3 – E. coli JM107 LKp3b; 4 – E. coli JM107 LKp3y; 5 – E. coli JM107.

Результаты секвенирования транскриптов и данные их сравнительного анализа с известными генами B. pseudomallei (рис. 16) подтвердили принадлежность клонированных последовательностей к эффлюкс-детерминантам AcrB/AcrD/AcrF и QacE типов.

223 272

B.pseudomallei amrB gene (223) CTGCTGTACACGTCGGCGACGAGCAGCGCCGGCCAGGCGTCGCTGTCGCT

amrB_LKp2 (1) --------------------------------------------------

amrB_LKp3b (1) -------------------------------GCCAGGCGTCGCTGGCGCT

273 322

B.pseudomallei amrB gene (273) CACGTTCAAGCAGGGCGTGAGCGCCGATCTCGCGGCCGTCGACGT-GCAG

amrB_LKp2 (1) ----------------------------------------GACGA-GCAG

amrB_LKp3b (20) CACGTTCAAGCAGGCCGTGAGCCCTCTTCTCGCGGCCGTCGACGCTGCAG

323 372

B.pseudomallei amrB gene (322) AACCGCCTGAAAATCGTCGAGGCGCGGCTGCCCGAGC-CCGTGCGGCGCG

amrB_LKp2 (10) AACCGCCTTGAAATCGTTGTCTCTTGGCTGCCCTAGCGCCGTTCGGCACC

amrB_LKp3b (70) AACCGCCTGTAAATCGT--GCTGGGGGCTGCCCTAGCCCCGTTCGGCACC

373 422

B.pseudomallei amrB gene (371) ACGGCATCTCGATCGAGAAGGCGGCC--GACAACGCGCAGATCATCGTGT

amrB_LKp2 (60) ACGCCAGCTCGATCGAGAAGGCAGCC--GAGAACGCGCAGATCATC-TGT

amrB_LKp3b (118) ACGCGTGTTCGATCGAGAAGGCCGCCTCGAGGTCGCGCAGATCATCCTGT

423 472

B.pseudomallei amrB gene (419) CGCTCACGTCGGAGGACGGACGGATATCGGGC-GTGGAGCTCGGCGAATA

amrB_LKp2 (107) CGCTGACGTCGGAGGATCGACGGATATCGGGCAGTGGAGCTCGCAGGATA

amrB_LKp3b (168) CGCTCACGTCGGAGGGCCGACGGATATCGGGCATGGGAGCTCGCAGGATA

473 522

B.pseudomallei amrB gene (468) CGCGTCGGCGAACGTGTTGCAGGCGCTGCGGCGCGTCGAGGGCGTCGGCA

amrB_LKp2 (148) CGCGTCGGCGAACGTGTTGCAGGCGCTGCGGCGCGTCGAGGGCGTCGTTG

amrB_LKp3b (209) CGCGTCGGCGAACGTGTTGCAGGCGCTGCGGCGCGTCGAGGGCGTCTTGG

523 572

B.pseudomallei amrB gene (518) AGGTGCAGTTCTGGGGCGCCGAGTATGCGATGCGGATCTGGCCGGACCCC

amrB_LKp2 (194) AGGTGCAGTGGCGGGGCGCCGAGTATGCGAACTGGATCTCGCCGAAA---

amrB_LKp3b (256) AGGTGCAGTGGCGGGGCGCCGAGTATGCGAACTGGATCTCGCCGAAAATT

573 585

B.pseudomallei amrB gene (568) GTGAAGATGGCGG

amrB_LKp2 (241) -------------

amrB_LKp3b (304) T------------

1 50

qacE (BPSL1861) (1) ----ATGCAACTTCCAGGTTACGCATG-GCTCGCGATCGCG----ATCGT

emrE_LKp3b (1) GGGGATGCAACTTCCAGGTTACGCAGAAGCTCGCGATCGCGCACAATCGT

51 100

qacE (BPSL1861) (42) CGCCGAGGTGGTCGGCACGTCGGCGCTGCGCGCAGCCGAAGGTTTCACGC

emrE_LKp3b (51) CGCCCAGGTGGTC--CACGCCGGCGCTCAGCGCAGCCGAAGGTTTCA---

101 150

qacE (BPSL1861) (92) GGCTCTGGCCGACGCTCGTCGTCGCCCTCGGCTACGGCACCGCGTTCTAC

emrE_LKp3b (96) -GCTCTGGCCGACGCTCCACGTCGCCC-CGGCTACGGCACCGCGTTCTAC

151 200

qacE (BPSL1861) (142) TGCCTGTCGCTCACGCTCAAGAGCATGCCCGTCGGCATCGTGTACGCGAT

emrE_LKp3b (140) TGCTGGTCGCTCACCCTCAAGAGCATGCCAGTCGGCACCGTGTACGCGAT

201 250

qacE (BPSL1861) (192) CTGGTCGGGCGCGGGCATCGTGCTCATCACGCTC-GTCGCGCTCGTGCTC

emrE_LKp3b (187) CTGGTCAGGCAAGGACATTC-GCTCATCACGCTCCGTCACAGTCGTGCTC

251 300

qacE (BPSL1861) (241) TATCGGCAGGTGCCGGACTGGCCCGCGGTCGTCGGGCTCGCGCTCATCGT

emrE_LKp3b (236) TATAGGCAGGTGACGGACTGCCCCGCGGTCGTCGGGCTCGCGCCCCTCGT

301 350

qacE (BPSL1861) (291) CGCGGGCGTCGTGGTGCTCAATCTCTTTTCGAAAATGCAGGCGCATTGA-

emrE_LKp3b (284) CGCGGGCGTCGTGGTGCTCGATGT-TTGTCGACG--GCAGGCACTTTGAT

Рис. 16. Сравнительный анализ генов amrB и qacE B. pseudomallei и секвенированных последовательности транскриптов рекомбинантного штамма E. coli JM107 LKp3b.

Blog