Молекулярные механизмы формирования множественной лекарственной резистентности у Burkholderia pseudomallei и близкородственных видов микроорганизмов 03. 00. 07 микробиология 03. 00. 15 генетика

Вид материала

Автореферат

Содержание B. pseudomallei, B. mallei B. pseudomallei B. pseudomallei B. thailandensis B. pseudomallei Апробация работы Объем и структура работы Содержание работы B. pseudomallei, B. thailandensis B. mallei B. pseudomallei B. pseudomallei B. pseudomallei B. mallei B. mallei B. mallei B. mallei B. thailandensis B. thailandensis B. pseudomallei ... Полное содержание

Подобный материал:

• Л. И. Параллелизмы в молекулярной организации генома и проблемы эволюции. В кн.: Молекулярные, 251.18kb.
• Особенности эволюции морфологических и молекулярных признаков на примере близкородственных, 1418.11kb.
• Патогенетические компоненты лечения туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью, 210.94kb.
• Рабочая программа дисциплины «нормальная микрофлора человека» Код дисциплины по учебному, 110.88kb.
• 1. введение в микробиологию > 1 Предмет и задачи микробиологии. Основные свойства микроорганизмов, 1814.12kb.
• Рабочая программа дисциплины «роль микроорганизмов в жизни растений» Код дисциплины, 88.04kb.
• Рабочая программа дисциплины «экология микроорганизмов» Код дисциплины по учебному, 219.98kb.
• А. В. Низова [и др.] // Эпидемиология и инфекц болезни. 2007. N c. 7-11, 85.01kb.
• Рабочая программа дисциплины «жизнь микроорганизмов в экстремальных условиях» Код дисциплины, 123.41kb.
• Лекция 1 Введение. Основные принципы классификации микроорганизмов. Различия архебактерий,, 46.21kb.

Положения, выносимые на защиту

1. Штаммы B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis обладают выраженной способностью к формировнию резистентности высокого уровня к антибиотикам фторхинолоновой и цефалоспориновой групп при культивировании на питательных средах с повышающимися концентрациями антибатериальных агентов.
   
2. Устойчивые к фторхинолоновым и цефалоспориновым соединениям мутанты буркхольдерий отличаются стабильным сохранением приобретенного фенотипа резистентности и развитием перекрестной устойчивости к отдельным -лактамам, аминогликозидам, макролидам, хлорамфениколу и ряду неспецифических ингибиторов.
   
3. Формирование резистентности множественного типа у микроорганизмов группы «pseudomallei» сопровождается изменениями белкового состава клеточных мембран, являющимися показателем модификации транспортных функций и проницаемости поверхностных структур клеток. Гиперпродукция мажорных мембранных белков M_r 27, 39, 48, 71 и 110 kDa и значительное снижением синтеза протеинов M_r 45 и 49 kDa у мутантов B. pseudomallei и B. thailandensis ассоциирована с высоким уровнем устойчивости к фторхинолоновым и цефалоспориновым антибиотикам.
   
4. Развитие резистентности множественного типа обусловливает комплексные адаптивные перестройки процессов мембранного транспорта и синтеза поверхностных структур клеток буркхольдерий, выражающиеся в структурных модификациях ЛПС, изменении продукции экзополисахарида и способности секретировать комплекс экстрацеллюлярных ферментов.
   
5. Включение Tn9 и Тn5 в хромосомные локусы детерминант мембранных протеинов 21, 27, 48, 71, 110 kDa B. pseudomallei приводит к снижению устойчивости инсерционных мутантов к препаратам цефалоспоринового и фторхинолонового ряда. Инсерционный мутагенез полирезистентного варианта B. pseudomallei демонстрирует связь утраты устойчивости к цефтазидиму с дефектами продукции мажорных мембранных протеинов 27 и 71 kDa.
   
6. Ведущая роль в формировании множественной антибиотикорезистентности B. pseudomallei принадлежит механизмам эффлюкса, что демонстрирует анализ динамики накопления и выброса стуктурных аналогов антимикробных соединений клетками штамма дикого типа и полирезистентных мутантов, а также снижением устойчивости исходных и мутантных штаммов B. pseudomallei к антибиотикам различных классов в присутствии соединений - блокаторов мембранного транспорта.
   
7. Сравнительный анализ in silico известных и предполагаемых генов лекарственного эффлюкса B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis является эффективным инструментом выбора последовательностей-мишеней и подбора олигонуклеотидных праймеров для оценки уровня экпрессии генов лекарственных транспортеров MFS, SMR и RND типов.
   
8. Участие AcrB/AcrD/AcrF, QacA/EmrB и QacE эффлюкс-детерминант в формировании антибиотикорезистентности множественного типа у видов группы «pseudomallei» подтверждается индукцией и возрастанием экспрессии данных лекарственных транспортеров у исходных штаммов и полирезистентных мутантов, культивируемых в присутствии антибиотиков фторхинолонового и цефалоспоринового рядов. Экспрессия клонированных последовательностей AcrB/AcrD/AcrF и QacE эффлюкс-транспортеров возбудителя мелиоидоза в Escherichia coli приводит к появлению резистентности рекомбинантных клонов к препаратам фторхинолоновой и аминогликозидной групп.
   
9. Мутационные изменения ДНК-гиразы А, наряду со снижением проницаемости оболочки и активацией эффлюкс-систем, определяют развитие высокого уровня резистентности к соединениям фторхинолоновой группы у B. pseudomallei и B. mallei. Нуклеотидные замены в QRDR gyrA у мутантных штаммов приводят к нескольким типам аминокислотных замен в последовательности белка (Thr83Ile, Gly81Cys и Asp87Tyr).
   
10. Геномы штаммов B. pseudomallei и B. thailandensis несут участки, структурно сходные с интегронами и представленные генами транспозаз/интеграз и кодирующими последовательностями детерминант лекарственной устойчивости - эффлюкс-транспортеров MFS и RND семейств. Наличие интегроноподобных структур свидетельствует о потенциальной возможности формирования множественной устойчивости у данных микроорганизмов за счет аккумуляции и горизонтального переноса R-детерминант различных типов.
    

Апробация работы

Диссертация выполнена на основе 14 государственных плановых тем НИР, в 3 из которых соискатель являлся ответственным исполнителем, и в 3 – научным руководителем. Основные результаты исследований изложены в 62 опубликованных работах, в том числе в пяти патентах на изобретение и трех учебных пособиях.

Результаты исследований по теме диссертационной работы были представлены на международном конгрессе «Vaccine & Immunization» (Manchester, 1999), международной конференции «Problems of biological and ecological safety» (Оболенск, 2000), международных конференциях «Natural infectious diseases» (Ulaan Baator, 2001, 2002, 2003), IV и V межгосударственных научно-практической конференций «Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней» (Саратов, 2003; Саратов, 2004), VI Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Санитарная охрана территорий государств-участников СНГ: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005), VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (Саратов, 2007), VI Всероссийской научно-практическая конференции с международным участием «Генодиагностика инфекционных болезней – 2007» (Москва, 2007), II, IV и VI всемирных конгрессах по мелиоидозу (The 2^nd World Melioidosis Congress, Bangkok, Thailand, 1998; The 4^th World Melioidosis Congress, Perth, Australia, 2001; The 6^th World Melioidosis Congress, Khon Kaen, Thailand, 2007), IХ Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-участников Содружества Независимых Государств» (Волгоград, 2008).


Объем и структура работы

Диссертация изложена в форме монографии на 266 листах компьютерного текста, состоит из введения, 5 глав, содержащих необходимые литературные справки, теоретические и экспериментальные разделы и иллюстрации в виде 28 таблиц и 83 рисунков, заключения и выводов. Указатель литературы включает 515 источников.


СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ


Анализ особенностей формирования множественной лекарственной резистентности у Burkholderia pseudomallei и близкородственных микроорганизмов


Получение и характеристика мутантов B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis с фенотипом множественной антибиотикорезистентности. Приступая к выполнению данной работы, мы должны были, в первую очередь, сформировать определенный набор штаммов исследуемых видов микроорганизмов, несущих генетические детерминанты измененной чувствительности к тем или иным группам антибактериальных препаратов. При этом необходимо было учитывать то обстоятельство, что большинство микроорганизмов рода (в том числе, виды, относящиеся к группе «pseudomallei») характеризуются высокой природной устойчивостью к антибиотикам различным групп, являясь, по сути дела, природно полирезистентными. Таким образом, основными задачами начального этапа исследований мы считали подбор фенотипических маркеров устойчивости, анализ появления и наследования которых не был бы затруднителен в силу исходно высокого уровня резистентности штаммов микроорганизмов к соответствующему антибактериальному препарату, и селекцию клонов со стабильно сохраняющимися фенотипами резистентности. Исследования по получению коллекции полирезистентных вариантов B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis включали в себя этапы оценки уровней устойчивости исходных штаммов микроорганизмов к антибиотикам различных групп, выбора подходящих селективных маркеров и схем получения резистентных вариантов, анализа динамики формирования и стабильности наследования новых фенотипов устойчивости, а также изучения перекрестной резистентности полученных вариантов к антимикробным соединениям других классов.

В качестве селективных агентов при анализе особенностей формирования различных профилей лекарственной резистентности у B. pseudomallei, B. thailandensis и B. mallei нами были избраны препараты групп цефалоспоринов III поколения (цефтазидим) и фторхинолонов (пефлоксацин, офлоксацин), отличающиеся высокой активностью в отношении всех имеющихся в нашем распоряжении штаммов B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis. Препараты этих классов антимикробных соединений стандартно используются в существующих схемах экстренной и пролонгированной терапии мелиоидоза (Inglis et al., 2006; Wuthiekanun, Peacock, 2006), наряду с этим, неоднократно были описаны случаи развития резистентности возбудителя к ним в ходе лечения (White et al., 1989; Dance et al., 1989; Dance et al., 1991; Chaowagul et al., 1997). Кроме того, установлено, что развитие устойчивости к отдельным группам антибиотиков довольно часто сопровождается формированием множественной резистентности. Это, в частности, отмечено для антибиотиков фторхинолонового ряда (Deguchi et al., 1997; Jalal, Wretlind, 1998; Zhang et al., 2001; Jellen-Ritter, Kern, 2001; Join-Lambert et al., 2001; Baucheron et al., 2002; Dewi et al., 2004; Wolter et al., 2004).

Первоначальные попытки получения резистентных к фторхинолонам и цефтазидиму мутантов исследуемых видов буркхольдерий на плотных и жидких питательных средах с двукратным приращением концентрации антибиотиков начиная с ингибирующей не увенчались успехом, что в конечном счете привело нас к выбору схемы селекции, предусматривающей постепенное плавное повышение концентраций антибактериальных агентов, начиная с субъингибирующих. Клоны B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis, стабильно сохраняющие фенотип устойчивости к фторхинолонам или цефтазидиму, были использованы для селекции вариантов с множественной устойчивостью, при этом, для сохранения первичного фенотипического маркера резистентности применялась поочередная смена селектирующих агентов. В результате были отобраны Pfx^R Caz^R, Caz^R Pfx^R, Caz^R Ofx^R и Ofx^R Caz^R мутанты штаммов B. pseudomallei, Pfx^R Caz^R варианты B. thailandensis, тогда как селекционировать мутанты B. mallei, резистентные одновременно к антимикробным соединениям обеих групп (фторхинолоны и цефалоспорины) не удалось.

Анализ сохранения фенотипов резистентности мутантов при культивировании либо длительном хранении (6 и более месяцев) в неселективных условиях продемонстрировал, что наибольшей стабильностью отличается устойчивость к препаратам фторхинолонового ряда, тогда как устойчивость к цефтазидиму имела тенденцию к снижению при культивировании резистентных вариантов вне селективного давления. Исследования спектров перекрестной устойчивости полученных мутантов показали, что у B. pseudomallei и B. thailandensis резистентность, первично индуцированная препаратами фторхинолонового ряда, а затем цефтазидимом, сопровождается возрастанием устойчивости к другим фторхинолонам, гентамицину, эритромицину, ампициллину и хлорамфениколу, тогда как индукция устойчивости в направлении «цефтазидим-фторхинолоны» приводила к более выраженному возрастанию резистентности к препаратам -лактамной и аминогликозидной групп. Интересно, что в работе Rajyaguru J.M. и Muszynski M. J. был получен во многом аналогичный результат на модели B. cepacia – резистентные мутанты, селекционированные хлорамфениколом, имели значительно возросший уровень устойчивости к антибиотикам фторхинолоновой группы и цефтазидиму (Rajyaguru, Muszynski, 1997).

Несмотря на то, что не удалось выделить мутанты B. mallei с высоким уровнем устойчивости к обеим группам антимикробных соединений, тем не менее, отдельные резистентные к пефлоксацину варианты B. mallei имели отчетливо возросшую устойчивость к другим фторхинолоновым антибиотикам и незначительно увеличенную резистентность к отдельным аминогликозидам и хлорамфениколу. Данные о фенотипах резистентности исходных и полученных штаммов приведены в таблице 1.


Табл. 1.

Резистентность исходных штаммов и селекционированных мутантов буркхольдерий к антибиотикам различных классов

Штамм	МПК антибиотиков (мкг/мл)
	PFX	OFX	CIP	CAZ	AMP	GEN	ERY	DOX	CML
B. pseudomallei 56770	8	8	4	10	64	64	64	4	16
B. pseudomallei 56770 SMCP	128	>64	64	>256	>512	>128	>128	4	32
B. pseudomallei 56770 SMPC	>128	>128	64	>64	256	128	>128	4	>256
B. pseudomallei 56770 SMOC	>128	>128	>64	>64	>128	>128	>128	2.5	>256
B. mallei Ц-5	2	2	1	4	32	2	32	0.5	8
B. mallei Ц-5 SMC	2	2	1	>128	256	2	>64	1	8
B. mallei Ц-5 SMP-150-2	>128	64	16	4	32	2	32	1	16
B. mallei Ц-5 SMP-150-3	>128	32	32	4	32	2	32	0.5	8
B. thailandensis E264	10	12	8	10	64	32	32	4	32
B. thailandensis E264 SMPC	>128	>128	>64	64	>128	>128	256	4	256

Обозначения: PFX – пефлоксацин, OFX – офлоксацин, CIP – ципрофлоксацин, CAZ – цефтазидим, AMP – ампициллин, GEN – гентамицин, ERY – эритромицин, DOX – доксициклин, CML – хлорамфеникол.


Важно отметить, что варианты B. pseudomallei и B. mallei с измененной экспрессией эффлюкс-белков и компонентов секреторных систем оказались существенно аттенуированными для различных биологических моделей. Так, их вирулентность для золотистых хомячков оказалась снижена на 5-6 порядков (LD₅₀ > 10⁶ ж.м.к.), для белых мышей – практически утрачена (отсутствие гибели животных, инфицированных дозами 10⁸ ж.м.к.).


Изменение проницаемости и транспортных систем клеточных мембран при развитии множественной резистентности Burkholderia


Экспрессия мембранных белков у мутантов B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis с различными фенотипами резистентности. Определенные характеристики полученных мутантных штаммов, а именно их перекрестная устойчивость к антимикробным соединениям, которые не использовались при селекции, позволили нам сделать предположение о возможной роли процессов снижения проникновения антибиотиков, либо их активного выброса в формировании наблюдаемых фенотипов резистентности и исследовать характер изменений систем мембранного транспорта у полученных полирезистентных вариантов буркхольдерий. Анализ изменений белкового состава клеточных мембран был начальным этапом исследований в данном направлении.

Сравнительное исследование в SDS-PAGE белков наружных мембран штаммов B. pseudomallei дикого типа и их резистентных к отдельным антибактериальным препаратам мутантов показало, что мутантные штаммы, в целом, характеризовались снижением уровня продукции мажорных мембранных протеинов и прекращением продукции отдельных белков с молекулярными весами в диапазонах 39 – 70 kDa и 27 – 30 kDa. Совершенно иной, по сравнению с «монорезистентными» вариантами, характер изменений экспрессии белков наружных мембран был обнаружен у мутантов B. pseudomallei со стабильно сохранямыми Pfx^R Caz^R, Caz^R Pfx^R, Caz^R Ofx^R и Ofx^R Caz^R фенотипами резистентности. У всех полирезистентных вариантов наблюдалась гиперпродукция мажорных белков 27, 39, 48, 71 и 110 kDa и, вместе с тем, прекращение синтеза протеина 45 kDa, а также некоторое снижение продукции белка 49 kDa (рис. 1).




Рис. 1. SDS-PAGE (A) и иммуноблоттинг (B) белков наружных мембран исходного штамма B. pseudomallei 56770 и его полирезистентных мутантов. Штаммы: 1 – дикий тип; 2 - 56770 SMPC; 3 - 56770 SMCP; 4 - 56770 SMOC.


Характер изменений в продукции мембранных протеинов, сходный с выявленным у полирезистентных мутантов B. pseudomallei, наблюдался также у полирезистентных производных B. thailandensis и, в меньшей степени, у B. mallei, чьи мутанты, резистентные к фторхинолоновым антибиотикам, характеризовались прежде всего снижением количества мажорных мембранных белков 21, 42, 45 kDa и группы минорных протеинов 70 - 100 kDa. Проведенные исследования, таким образом, обозначили определенную закономерность в изменении экспрессии протеинов наружных мембран у видов Burkholderia при формировании полирезистентных фенотипов, выражающуюся, наряду с дефектами по отдельным белкам, в возрастании экспрессии группы мембранных протеинов - 110, 71, 48, 39, 27 и 21 kDa.

Известно, что снижение экспрессии или утрата поринов мембран является одной из общих, закономерных черт адаптивного ответа бактерий на воздействие антимикробных соединений (Livermore, 1984; Nikaido, 1989), имеющей, вместе с тем, свои отличительные особенности, как в зависимости от таксономической принадлежности микроорганизма, так и от физико-химических свойств и механизмов действия антибиотика (Guymon et al., 1978; Irvin et al., 1981; Angus et al., 1982; Parr et al., 1987; Bakken et al., 1987; Aronoff, 1988). Вместе с тем, анализ механизмов устойчивости к антибиотикам различных классов, в том числе хинолонам и их фторированным производным, у различных грамнегативных бактерий показывает, что ограничение поступления антибиотиков вследствие изменения экспрессии поринов наружной мембраны является первичным этапом процесса формирования резистентности, опосредованно приводящим к увеличению частоты мутаций по различным геномным локусам в целом, и дальнейшей селекции клонов с модифицированными мишенями действия препаратов (Cohen et al., 1989; Chamberland et al., 1989b), либо активированными системами выведения антибиотиков из клеток (Sabath, 1984; Ishii et al., 1991).

Суммируя полученные результаты и известные данные литературы, можно было предположить, что формирование устойчивости к антимикробным препаратам различных классов у В. pseudomallei, B. mallei и В. thailandensis обусловлено как возрастанием экспрессии аппарата активного выброса антибиотиков (multidrug efflux), так и снижением проницаемости клеточной оболочки за счет утраты, либо пониженной экспрессии отдельных поринов.


Получение и характеристика мутантов Burkholderia, дефектных по продукции мембранных белков. Для подтверждения выдвинутого предположения и более детальной оценки роли мембранных протеинов в реализации резистентности к антимикробным соединениям мы поставили перед собой задачу, используя техники мутагенеза, разработанные ранее для возбудителей мелиоидоза и сапа (Меринова и др., 1997; Меринова, 1998), получить мутанты исследуемых видов буркхольдерий, дефектные по продукции отдельных мембранных белков и провести анализ влияния утраты, либо снижения продукции мембранных протеинов на резистентность к отдельным группам антибиотиков. Кроме того, представлялось интересным получить мутанты со сниженной устойчивостью к тем или иным антибиотикам, используя в качестве исходных штаммов селекционированные полирезистентные мутанты, и исследовать возможные реаранжировки белковых спектров наружных мембран при утрате какого-либо фенотипического маркера резистентности

Мутанты патогенных буркхольдерий, недостаточные по продукции мембранных протеинов (Bop^-), были индуцированы включением в хромосому транспозонов Tn9 и Тn5. Полученные мутанты B. pseudomallei и B. mallei отличались дефектами, либо сниженной продукцией ряда мембранных белков (21, 27, 48, 71, 110 kDa) и уменьшением устойчивости к цефалоспориновым и фторхинолоновым антибиотикам (рис. 2, табл. 2). Естественно, приведенные данные не являются достаточными для оценки, как таковой, функциональной роли отдельных мембранных протеинов, тем не менее, они обозначают ряд мембранных белков, изменения в продукции которых оказывают влияние на уровень резистентности бактерий к антибиотикам различных групп. Для подтверждения связи экспрессии отдельных мембранных протеинов и резистентности исследуемых микроорганизмов к антибактериальным препаратам мы предприняли попытку получения мутантов со сниженной устойчивостью к антибиотикам на основе полирезистентных мутантных штаммов.





Рис. 2. Белки наружных мембран клеток исходного штамма и инсерционных мутантов B. pseudomallei. Обозначения: 1 - B. pseudomallei 57576, 2 - B. pseudomallei 57576 TTM6, 3 - B. pseudomallei 57576 TTM7, 4 - B. pseudomallei 57576 TTM9.


Табл.2.

Устойчивость Tn5-индуцированных Bop^- мутантов B. pseudomallei к антибиотикам фторхинолоновой и цефалоспориновой групп

	МПК препаратов*
	CAZ, мкг/мл	PFX, мкг/мл	OFX, мкг/мл
B. pseudomallei 57576	12	8	8
B. pseudomallei 57576 T4	12	8	6
B. pseudomallei 57576 TTM6	5	2.5	3
B. pseudomallei 57576 TTM7	5	3	3
B. pseudomallei 57576 TTM9	10	5	5

Плазмида RP1::Tn9 Rep ts была передана в клетки мутанта B. pseudomallei 57576 SMCP Caz^R Pfx^R Ofx^R. Трансконъюганты от скрещивания тестировали на средах с цефтазидимом и пефлоксацином, отбирая клоны cо сниженной резистентностью. Удалось выделить клон (B. pseudomallei 57576 SMRT21), утративший резистентность только к цефтазидиму (Caz^S Pfx^R Ofx^R); МПК антибиотика для него составила 12 мкг/мл, что соответствовало уровню штамма дикого типа. Анализ в SDS-PAGE белков наружных мембран B. pseudomallei 57576 SMRT21 демонстрировал, что утрата устойчивости к цефтазидиму сопровождается дефектами продукции мажорных мембранных протеинов 27 и 71 kDa (рис. 3).




Рис. 3. SDS-PAGE белков наружных мембран клеток B. pseudomallei 57576 SMCP (1) и B. pseudomallei 57576 SMRТ21 (2).


Таким образом, результаты серии экспериментов по получению и первичной характеристике инсерционных Bop^- мутантов показали, что отдельные протеины наружной мембраны (110, 71, 48, 27 и 21 kDa) могут непосредственно участвовать в процессах формирования у патогенных видов Burkholderia резистентности высокого уровня к антибиотикам фторхинолоновой и цефалоспориновой групп.

В целом, полученные результаты свидетельствовали в пользу того, что мембранные протеины, уровень продукции которых был ассоциирован с измененной чувствительностью к антибиотикам, являются компонентами транспортных систем, участвующих в активном выбросе антибатериальных препаратов из клеток во внешнюю среду либо обеспечивающих селективное проникновение антибиотиков в клетку извне.


Проницаемость клеточных мембран и эффлюкс антимикробных соединений у полирезистентных вариантов Burkholderia. Для дальнейшей оценки роли систем мембранного транспорта в развитии множественной антибиотикорезистентности мы провели сравнительные исследования проницаемости клеточных оболочек, процессов энергозависимого эффлюкса антимикробных соединений и их аналогов, и изменений в продукции и транспорте отдельных внеклеточных и поверхностных биополимеров у штаммов буркхольдерий, отличающихся чувствительностью к антибиотикам.

Известно, что наружные мембраны клеток грамотрицательных бактерий служат эффективным барьером, ограничивающим поступление из внешней среды различных соединений, ограничивающих жизнеспособность микроорганизмов (Nikaido, Vaara,1985; Vaara, 1992). Исходно низкая проницаемость поверхностных структур клетки для ряда антимикробных соединений является одной из составляющих внутренней, природной лекарственной резистентности (intrinsic resistance) у ряда видов бактерий. Активация эффлюкс-систем клетки также вносит свой вклад в реализацию резистентности к токсичным для микроба соединениям. Имея в своем распоряжении ряд штаммов с измененной чувствительностью к антибиотикам, мы попытались оценить соотношение снижения проницаемости мембран и процессов эффлюкса в феномене развития множественной лекарственной устойчивости у возбудителя мелиоидоза.

Изучение уровня устойчивости исходных и мутантных штаммов к ряду неспецифических ингибиторов, способных к эффективному проникновению через мембраны бактериальных клеток (жирные кислоты, соли желчных кислот, детергенты и красители) показали существенное снижение мембранной проницаемости полирезистентных мутантов B. pseudomallei для целого ряда соединений различной химической природы и физико-химических свойств. Для оценки составляющей активного эффлюкса в реализации резистентности к антибиотикам и неспецифическим ингибиторам мы исследовали влияние блокаторов мембранного транспорта на уровень устойчивости мутантов и штамма дикого типа к отдельным антибиотикам, а также процессы аккумуляции и выведения из клеток микроорганизмов бромистого этидия (EtBr), часто используемого в анализе транспортных мембранных систем в качестве структурного аналога антимикробных соединений фторхинолонового ряда (Kumar, Worobec, 2002; Godreuil et al., 2003; Brenwald et al., 2003; Xu et al., 2003; Rouquette-Loughlin et al., 2003; Li et al., 2004; Rafii et al., 2005; Martins et al., 2006).

Полученные нами результаты выявили существенную разницу в скорости накопления и количестве аккумулированного красителя в клетках штамма дикого типа и мутантов с высоким уровнем устойчивости к фторхинолоновым и цефалоспориновым антибиотикам, при этом мутантные штаммы с преобладающей устойчивостью к фторхинолоновым соединениям характеризовались отчетливо меньшей проницаемостью мембран для данного соединения (рис. 4). Анализ процессов эффлюкса EtBr показал, что максимальная скорость выброса ингибитора была у клеток полирезистентных мутантов (рис. 4).

Энергозависимый характер процесса выброса бромистого этидия клетками мутантного штамма B. pseudomallei был продемонстрирован в серии дальнейших экспериментов при исследовании влияния температуры и наличия источника энергии в среде на кинетику эффлюкса EtBr (рис. 5).



A

B



Рис. 4. Динамика накопления (А) и выброса (В) бромистого этидия клетками B. pseudomallei 56770 и мутантов с множественной антибиотикорезистентностью.



4C


Рис. 5. Динамика выброса бромистого этидия клетками B. pseudomallei 56770 SMOC при различных температурах (А) и наличии источника энергии (В).


Взятые вместе, результаты проведенных исследований подтверждали значимую роль эффлюкса антимикробных соединений при формировании резистентности множественного характера, в связи с чем нами был проведен ряд дополнительных экспериментов по оценке влияния верапамила - соединения, блокирующего мембранные транспортеры (Ng et al., 1994; Banerjee et al., 1996; Choudhuri et al., 2002; Lee et al., 2003), на уровень резистентности исходного и мутантных штаммов B. pseudomallei к антибиотикам различных групп (рис. 6).

Как показал проведенный анализ, присутствие верапамила в целом приводило к снижению устойчивости исходных и мутантных штаммов к антимикробным соединениям, однако характер снижения отличался в каждом конкретном случае. Так, исследование динамики выживания клеток штамма дикого типа и мутантов под воздействием гентамицина продемонстрировала тенденцию к снижению числа жизнеспособных клеток в присутствии фиксированных концентраций верапамила, при этом у мутантных штаммов снижение выживаемости инокулума наблюдали лишь в определенных диапазонах концентраций антибиотика. Оценка влияния верапамила на выживаемость бактериального инокулума в присутствии фиксированных концентраций (субМПК по отношению к штамму дикого типа) антибактериальных препаратов различных групп в большинстве случаев также показала снижение количества жизнеспособных клеток, при этом угнетающее воздействие верапамила на рост культур полирезистентных мутантов хорошо прослеживалось на средах, содержащих препараты фторхинолоновой группы, тетрациклины и аминогликозиды. Отметим, однако, что набор антибиотиков, устойчивость к которым подавлялась верапамилом, для мутантных штаммов оказался существенно уже, чем для штамма дикого типа (рис. 6).



A

B

C

D





Рис. 6. Устойчивость штамма дикого типа B. pseudomallei 56770 (A) и его полирезистентныз производных B. pseudomallei 56770 SMPC Pfx^R Caz^R (B), B. pseudomallei 56770 SMCP Caz^R Pfx^R (C), B. pseudomallei 56770 SMOC Ofx^R Caz^R (D) к антибиотикам различных групп при воздействии блокатора мембранных каналов.


Изменения экспрессии поверхностных полисахаридов и систем секреции экзоферментов. Анализируя роль систем мембранного транспорта и изменения проницаемости клеточных оболочек в формировании антибиотикорезистентности у возбудителя мелиоидоза и близких ему видов Burkholderia, мы ставили перед собой в качестве одной из задач как можно более многоплановую оценку полирезистентных фенотипов у данной группы бактерий, в связи с чем нами были проведены исследования изменчивости некоторых поверхностных и внеклеточных биополимеров у полирезистентных мутантов B. pseudomallei, а именно изменений в структуре ЛПС, способности продуцировать экзополисахарид и внеклеточные ферменты «агрессии», то есть анализ модификации клеточных компонентов, причисляемых к факторам патогенности микроорганизма (Алексеев и др., 1984; Алексеев и др., 1994; Пивень, Илюхин, 2000; Brett, Woods, 2000).

Роль ЛПС, как внешнего барьера для различных антимикробных соединений, обусловлена его определенными физико-химическими характеристиками – анионными свойствами, числом межмолекулярных связей в коровом регионе и плотностью упаковки жирнокислотных цепей липида А (Snyder et al., 1999; Wiese et al., 1999). Барьерная функция ЛПС многократно подтверждена многочисленными исследованиями свойств мутантов различных видов бактерий, дефектных по продукции отдельных структурных компонентов ЛПС (Sukupolvi, Vaara, 1989; Plesiat, Nikaido, 1992; Vuorio, Vaara 1992; Helander et al., 1994; Helander et al., 1995; Plesiat et al., 1997; Plesiat, Vaara 1999; Nesper et al., 2001). Выявление возможных модификаций ЛПС при селективном воздействии антимикробных соединений, по нашему мнению, давало возможность более широко обозначить вероятные механизмы, лежащие в основе феноменологии множественной антибиотикорезистентности возбудителя мелиоидоза.

По данным SDS-PAGE, ЛПС-профили мутантов B. pseudomallei Pfx^R Ofx^R фенотипов отличались от исходного штамма числом и количественной выраженностью отдельных ЛПС-паттернов практически во всех диапазонах профиля - наблюдалась реаранжировка высокомолекулярных ( > 150 kDa) паттернов и существенная редукция числа низкомолекулярных (25 kDa и менее) фрагментов, что мы рассматриваем как свидетельство наличия структурных модификаций биополимера, сопряженных с возрастанием устойчивости к антибиотикам фторхинолоновой группы (рис. 7).




Рис. 7. SDS-PAGE ЛПС исходного штамма и полирезистентных мутантов B. pseudomallei. Окраска серебром. Штаммы: 1 – 56770; 2 – 56770 SMCP; 3 – 56770 SMPC; 4 – 56770 SMOC.


Логично предполагать, что изменения структуры ЛПС вносят свой вклад в изменение проницаемости клеточных оболочек мутантов B. pseudomallei и формирование устойчивости к отдельным антимикробным соединениям. Как было отмечено выше, структурные модификации ЛПС встречаются у мутантов различных видов бактерий с фенотипом множественной антибиотикорезистентности, часто, однако, изменения структуры ЛПС не являются ведущим фактором формирования резистентности, а скорее следствием комплексных адаптивных реакций клеток, тем не менее, дающим микроорганизмам дополнительные селективные преимущества (Chamberland et al., 1989; Rajyaguru, Muszynski, 1997; Ishikawa et al., 2002; Poole, 2002).

Экзополисахарид (капсульный полисахарид), продуцируемый многими видами грамотрицательных и грамположительных бактерий, является одним из важнейших факторов вирулентности (Pier et al., 1987; Cabral et al., 1987; May et al., 1991; Yu et al., 1995; Pier et al., 2001; Yu, Head 2002; Vuong et al., 2004), вместе с тем, неоднократно была показана роль экзополисахарида как экранирующего барьера в защите клеток бактерий от воздействия антибиотиков и антисептических соединений (Nickel et al., 1985; Morris et al., 1996; Vandenbroucke-Grauls, 1996; Desai et al., 1998; Ali et al., 2000; Hentzer et al., 2001; Campanac et al., 2002; Drenkard, Ausubel, 2002; Cunha et al., 2004; Arciola et al., 2005; Cerca et al., 2005). Подчеркнем также, что утрата способности продуцировать экзополисахарид также в отдельных случаях сопровождается повышением устойчивости микробов к некоторым группам антимикробных соединений, в частности, подобные особенности формирования резистентности к полипептидным антибиотикам были описаны у X. campestris, Sphingomonas spp. и E. coli (Pollock et al., 1994).

Исследования изменений продукции экзополисахарида у полирезистентных мутантов различных видов Burkholderia мы проводили с использованием двух методических подходов. Качественно способность продуцировать экзополисахарид оценивали методом, основанным на избирательном окрашивании экзополисахарид-негативных колоний микроорганизмов липофильным красителем судан черным В (Liu et al., 1998); для количественного соотнесения экзополисахарид-продуцирующей активности мутантных штаммов буркхольдерий за основу был взят метод окрашивания биопленок, формируемых бактериями на твердых субстратах (Ngwai et al., 2006). Результаты данной серии экспериментов приведены в таблице 3.


Табл. 3.

Продукция экзополисахарида исходными штаммами и полирезистентными мутантами различных видов Burkholderia

Штамм	Окрашивание Судан черным В	Формирование биопленок, А600 (р)
B. pseudomallei 56770	-	0.32 (0.01)
B. pseudomallei 56770 SMP	+	0.14 (0.05)
B. pseudomallei 56770 SMC	-	0.37 (0.01)
B. pseudomallei 56770 SMO	+	0.13 (0.01)
B. pseudomallei 56770 SMPC	+	0.17 (0.03)
B. pseudomallei 56770 SMCP	-	0.37 (0.02)
B. pseudomallei 56770 SMOC	-	0.29 (0.01)
B. mallei 10230	-	0.30 (0.01)
B. mallei 10230 SMP	+	0.11 (0.02)
B. mallei 10230 SMC	-	0.29 (0.02)
B. thailandensis E264	-	0.39 (0.03)
B. thailandensis E264 SMP	+	0.17 (0.01)
B. thailandensis E264 SMO	-	0.24 (0.07)
B. thailandensis E264 SMPC	-	0.27 (0.01)
B. cepacia 8235	-	0.36 (0.02)
B. cepacia 8235 SMPC	+	0.15 (0.02)
B. cepacia 8235 SMCP	-	0.39 (0.01)
B. cepacia 25416	-	0.34 (0.02)
B. cepacia 25416 SMPC	-	0.30 (0.03)
B. cepacia 25416 SMCP	-	0.35 (0.02)

При анализе данных, полученных в этой серии экспериментов, можно видеть, что дефекты в продукции экзополисахарида отмечались, прежде всего, у мутантных штаммов B. pseudomallei и B. mallei, имеющих высокий уровень устойчивости к препаратам фторхинолоновой группы, тогда как у мутантов, при получении которых в качестве селективных факторов первыми были использованы препараты группы цефалоспоринов, вообще не было выявлено вариантов со сниженной продукцией экзополисахарида, напротив, все штаммы этой группы обладали даже несколько более высокими показателями формирования биопленок (табл. 3).

Характер варьирования продукции экзополисахарида у мутантов буркхольдерий, принадлежащих к различным фенотипическим классам резистентности, по-видимому, является отражением изменений в экспрессии различных секреторных систем бактерий, в том числе, задействованных в транспорте компонентов данной поверхностной структуры. В пользу этого свидетельствуют также результаты изучения спектров внеклеточных ферментов полирезистентных мутантов.

Приобретение фенотипа множественной антибиотикорезистентности в ряде случаев может сопровождаться функциональной модификацией секреторных систем клеток I, II и IV типа (Poole, 2001; Poole, 2002; Poole, 2004; Poole, 2005; Marquez, 2005), что, как правило, приводит к значительным изменениям отдельных фенотипических свойств микроорганизмов. Как отмечалось ранее, некоторые из таких полирезистентных вариантов обладают повышенным уровнем продукции экзополисахарида и большей биофильм-формирующей способностью. Модификации спектров секретируемых белков, вызванные изменениями экспрессии секреторных аппаратов I, II (gsp, general secretory pathway) и IV типов, также является характерной особенностью изолятов с множественной антибиотикорезистентностью (Poole et al., 1993; Schlor et al., 1997; Hayashi et al., 2000; Peng et al., 2005; Linares et al., 2005; Gil et al., 2006; Zhu et al., 2006; Posadas et al., 2007).

Для оценки возможных модификаций секреторной активности полирезистентных мутантов B. pseudomallei мы исследовали спектры их экстрацеллюлярных протеинов и вариабельности ферментативной активности культуральных супернатантов бактерий. Полученные результаты обозначили определенную закономерность в изменении специфической экстрацеллюлярной энзимной активности у штаммов B. pseudomallei с различными фенотипами резистентности (рис. 8).

Мутанты, имеющие фенотип множественной резистентности, в целом, характеризовались снижением энзимной активности культуральных фильтратов, по сравнению с исходными штаммами и «монорезистентными» производными. Отметим, что полирезистентные варианты с высоким уровнем устойчивости к препаратам фторхинолонового ряда не продуцировали внеклеточных липаз и лецитиназ, кроме того, Pfx^R Caz^R фенотип практически полностью утрачивал экстрацеллюлярную протеолитическую активность (рис. 8).





Рис. 8. Ферментативная активность культурального супернатанта исходного штамма B. pseudomallei и мутантов, селекционированных в последовательности Ofx^R - Caz^R (A), Pfx^R - Caz^R и Caz^R - Pfx^R. Показаны средние значения диаметров зон гидролиза субстратов.


Таким образом, наряду со сведениями о характерных перестройках белкового спектра наружных мембран клеток, результаты анализа экспрессии поверхностных углеводсодержащих биополимеров и секреторной активности полирезистентных вариантов буркхольдерий, приведенные в данном разделе работы, являются еще одним подтверждением комплексного изменения процессов клеточного транспорта у исследуемых микроорганизмов при формировании устойчивости к антимикробным соединениям множественного типа. Судя по всему, эти изменения выражаются в модификации проницаемости клеточных оболочек и активации механизмов активного выведения антимикробных соединений из клеток во внешнюю среду. В число последних, по-видимому, вовлечены и sec-зависимые секреторные системы, ответственные за транспорт полипептидов и полисахаридных компонентов.