Разработка лабораторных экспресс-методов и технологии производства иммунодиагностических препаратов для выявления возбудителей листериоза и кампилобактериоза 03. 00. 07 Микробиология 03. 00. 23 Биотехнология

Вид материала

Автореферат

Содержание Научный консультант Ильин Вячеслав Константинович Владимцева Ирина Владимировна Общая характеристика работы Цель исследования Основные задачи исследования Научная новизна работы. Внедрение результатов в практику. Основные положения, выносимые на защиту Апробация работы. Структура и объем работы. Содержание работы Результаты исследований Таблица 1. Сравнительное изучение ростовых свойств опытных и контрольных питательных сред Разработка биотехнологии получения листериозных и кампилобактериозных диагностикумов для реакции агглютинации и реакции непрямой Таблица 2. Результаты сравнительного изучения специфической активности и специфичности полигрупповых агглю Таблица 3. Результаты объемной реакции агглютинации цветных диагностикумов в зависимости от использованного Конструирование листериозных и кампилобактериозных полигрупповых иммуноглобулиновых флуоресцирующих и иммунопероксидазных коньюг Таблица 4. Схема иммунизации кроликов с применением иммуномодуляторов тималина и циклофосфана Таблица 5. Схема иммунизации кроликов с применением тимогена ... Полное содержание

Подобный материал:

• Разработка идентификации bordetella bronchiseptica на основе иммунохимических и молекулярно-генетических, 373.19kb.
• Разработка диагностической биочиповой тест-системы для одновременного выявления возбудителей, 72.75kb.
• Общая биология и микробиология, 206.6kb.
• Разработка биологических препаратов для повышения питательности и эффективности использования, 672.8kb.
• Учебное пособие по курсу "Биотехнология" для студентов фармацевтического факультета, 1364.67kb.
• Контрольная работа по дисциплине Микробиология По теме Общая и специальная микробиология, 208.97kb.
• Рабочая программа дисциплины «биотехнология пищевых производств» Код дисциплины, 127.52kb.
• Разработка и внедрение технологии промышленного производства и системы управления качеством, 660.17kb.
• «Коксиеллез-ассоциированная инфекция крупного рогатого скота и усовершенствование лабораторных, 460.33kb.
• Разработка методов биотехнологического получения белков, аминокислот и нуклеозидов,, 735.56kb.

На правах рукописи

АЛИЕВА Елена Васильевна

Разработка лабораторных экспресс-методов и технологии производства иммунодиагностических препаратов для выявления возбудителей листериоза и кампилобактериоза


03.00.07 – Микробиология

03.00.23 – Биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук


Москва - 2008


Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении здравоохранения Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Роспотребнадзора


^ Научный консультант:

доктор медицинских наук,

профессор Тюменцева Ирина Степановна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор ^ Ильин Вячеслав Константинович


доктор медицинских наук,

профессор Митрохин Сергей Дмитриевич


доктор биологических наук,

профессор ^ Владимцева Ирина Владимировна

Ведущая организация: Государственное образовательное

учреждение высшего профессио-

нального образования Московская

медицинская академия им. И.М.Се-

ченова Росздрава


Защита состоится «____»________________2008 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 208.046.01 при Федеральном государственном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, г.Москва, ул. Адмирала Макарова, д.10


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского»


Автореферат разослан «____»___________2008 г.


Ученый секретарь Диссертационного совета,

доктор биологических наук С.Ю.Комбарова


^ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Структура инфекционной патологии человека за последние десятилетия претерпела существенные изменения, обусловленные как открытием целого ряда неизвестных ранее инфекционных агентов (возбудители ВИЧ-инфекции; гепатитов В, С и Д; геморрагических и арбовирусных лихорадок; легионеллеза и т.д.), так и изменением роли и удельного веса хорошо известных возбудителей. Ко второй группе наряду с возбудителями туберкулеза, условно патогенными бактериями широкого спектра, вызывающими гнойно-септические заболевания и пневмонии, в полной мере можно отнести кампилобактерии и листерии (Тартаковский И.С., Малеев В.В., Ермолаева С.А., 2002; Покровский В.И. и др., 2004). Хотя упомянутые микроорганизмы давно известны, в последние годы заметно расширился удельный вес вызываемых ими инфекций, равно как и спектр их клинических проявлений.

Кампилобактериоз (вибриоз) – инфекционная болезнь животных и человека, вызываемая патогенными микроорганизмами рода Campylobacter, которые интенсивно циркулируют во внешней среде (вода, домашние и дикие животные). Анализ данных литературы показывает, что кампилобактериоз довольно широко распространен на всех континентах и во многих странах мира. Вследствие довольно широкого географического распространения, циркуляции среди животных и людей, у которых это заболевание протекает чаще всего как токсикоинфекция, кампилобактериоз приобретает существенное социально-экономическое значение.

Листериоз относится к числу природно-очаговых инфекций. Возбудителем листериоза является грамположительная аспорогенная бактерия Listeria monocytogenes. Листериоз у людей проявляется спорадически, но также описаны многочисленные вспышки пищевого листериоза и внутрибольничные заболевания в родильных домах. Заражение в основном происходит при употреблении в пищу инфицированных продуктов животного и растительного происхождения.

Внимание к листериозу возросло после расшифровки в конце 80-х годов прошлого столетия вспышек пищевого листериоза у людей с летальностью до 33 % в США, Канаде, Мексике, Швейцарии, Великобритании, то есть в странах с традиционно высоким уровнем здравоохранения и технологий приготовления продуктов питания.

Анализ состояния лабораторной диагностики как кампилобактериоза, так и листериоза позволяет предположить, что зарегистрированный уровень заболеваемости представляет лишь «вершину айсберга» и при совершенствовании организационных и методических вопросов лабораторной диагностики число зарегистрированных больных может значительно возрасти.

Ранняя лабораторная диагностика, т.е. своевременное выявление источника инфекции занимают основное место в системе противоинфекционных мероприятий. Современная микробиология характеризуется развитием диагностических технологий, основанных на глубоких фундаментальных знаниях биологии микроорганизмов и передовых инженерно-технических решениях задач автоматизации и повышения эффективности анализа (Онищенко Г.Г. с соавт., 2003). В связи с этим возникает необходимость в совершенствовании имеющихся иммунобиологических методов, создании новых экспресс-методов диагностики и индикации, направленных на сокращение времени проведения анализа, его упрощение при одновременном увеличении надежности и легкости интерпретации полученных результатов при высокой чувствительности и специфичности.

^ Цель исследования: научная разработка экспресс-методов лабораторной диагностики возбудителей кампилобактериоза, листериоза и создание технологии производства медицинских иммунобиологических диагностических препаратов.

^ Основные задачи исследования:

1. Разработать транспортную, селективные и накопительные питательные среды для возбудителей кампилобактериоза и листериоза.

2. Подобрать эффективный метод извлечения специфических антигенов белковой природы из микробных масс возбудителей кампилобактериоза и листериоза для использования их при конструировании медицинских иммунобиологических препаратов.

3. Разработать производственные схемы получения иммунных сывороток с высокими титрами агглютининов и преципитинов и провести сравнительную оценку методов выделения из них иммуноглобулинов для дальнейшего их применения в качестве биологического сырья при производстве иммунобиологических препаратов.

4. Определить оптимальные параметры биотехнологии производства иммуноферментных и иммунофлуоресцентных кампилобактериозных и листериозных иммуноглобулиновых конъюгатов.

5. Разработать биотехнологию аффинных сорбентов с магнитными свойствами и на их основе создать тест-системы магноиммуносорбентные, а также методики их применения в экспресс-методах лабораторного анализа.

6. Определить параметры единого режима сублимации биополимеров (биологического сырья и МИБП) с целью сохранения их исходных свойств.

7. Оценить эффективность применения разработанных диагностикумов на экспериментальном, клиническом и полевом материале.

^ Научная новизна работы. Унифицирована питательная основа для транспортной, селективных, накопительных питательных сред, которые позволяют успешно выделять Campylobacter jejuni и Listeria monocytogenes от людей, животных, из пищевых продуктов, объектов внешней среды.

Подобраны эффективные методы, дающие возможность получения нативных специфических водорастворимых антигенных комплексов белковой природы из биомассы кампилобактерий и листерий.

Разработаны новые, высокоэффективные схемы иммунизации кроликов для получения специфических агглютинирующих и гипериммунных сывороток с высокими титрами.

Впервые осуществлена научно-методическая разработка биотехнологии производства кампилобактериозных и листериозных микрогранулированных органокремнеземных иммуносорбентов с магнитными свойствами, обладающих высокой сорбционной емкостью, стабильностью, чувствительностью, специфичностью.

Впервые сконструированы кампилобактериозные и листериозные магноиммуносорбентные тест-системы для иммуноферментного (ИФА) и количественного иммунофлуоресцентного (КИФА) анализов, позволяющие исследовать пробы из внешней среды с высокой степенью загрязнения неограниченного объема, низкой концентрацией патогена, с чувствительностью, в 1000 и более раз превышающей традиционные.

Материалы выполненных исследований легли в основу двух патентов РФ на изобретение № 2135210 от 27.08.1999 г. «Способ получения диагностической сыворотки» ; № 2290641 от 27.12.2006 г. «Способ проведения иммуноферментного анализа (ИФА)».

Практическая значимость работы.

Разработаны накопительные питательные среды с соответствующими добавками для наращивания биомасс кампилобактерий и листерий.

Подобраны эффективные методы и приемы по извлечению антигенного материала, получению иммунных сывороток и выделению иммуноглобулинов.

Оптимизация параметров конъюгации лигандов и маркеров позволили унифицировать биотехнологию производства ряда МИБП для экспресс-диагностики кампилобактериоза и листериоза, индикации их возбудителей (эритроцитарные, иммуноферментные, иммунофлуоресцентные), стабильно отвечающие общим медико-биологическим требованиям (ОМБТ), предъявляемым к индикационным препаратам.

Разработан единый ускоренный экономичный режим стабилизации биологического сырья и МИБП методом сублимации, позволяющий сохранять их исходные свойства длительное время.

Таким образом, создан алгоритм технологического процесса получения диагностических препаратов для индикации и идентификации возбудителей кампилобактериоза и листериоза, включающий в себя все этапы производства: от накопления биомассы на питательной среде до стабилизации полученных диагностических препаратов методом сублимационной сушки.

^ Внедрение результатов в практику.

Методики применения разработанных кампилобактериозных и листериозных МИБП изложены в «Методических рекомендациях по лабораторной диагностике листериоза у людей»; «Методических рекомендациях по лабораторной диагностике кампилобактериоза у людей»; «Методических рекомендациях «Магноиммуносорбенты в микробиологических и клинических исследованиях».

На диагностикумы листериозные эритроцитарные, флуоресцирующие, магноиммуносорбентные кампилобактериозные и листериозные для ИФА и КИФА составлена первичная нормативная документация (регламенты производства, фармакопейные статьи предприятия, инструкции по применению), прошедшая экспертизу в ОБТК СтавНИПЧИ, одобренная Ученым советом (протоколы №2 от 28.02.2002 г.; №6 от 26.06.2003 г.; № 2 от 28.02.2007 г.) и утвержденная директором института.

Материалы диссертации используются в лекциях и практических занятиях на курсах по повышению первичной специализации врачей по особо опасным инфекциям при СтавНИПЧИ, семинарах для практических врачей и научных работников МЗ РФ по экспресс-диагностике инфекционных заболеваний и применению магноиммуносорбентных препаратов в мониторинге инфекционных агентов.

^ Основные положения, выносимые на защиту

1. Предложены научно-методические подходы к получению биологического сырья (антигенов и антител) для производства кампилобактериозных и листериозных МИБП, которые дают возможность повысить их качество.
   
2. Разработаны методические приемы конструирования эритроцитарных, иммуноферментных, иммунофлуоресцентных диагностикумов, обеспечивающие высокую эффективность обнаружения антигенов кампилобактерий и листерий и антител к ним.
   
3. Создана биотехнология изготовления кампилобактериозных и листериозных твердофазных микрогранулированных композиционных аффинных органоминеральных магноиммуносорбентов; тест-системы магноиммуносорбентные для экспрессных методов иммуноанализа (ИФА, КИФА) позволяют максимально концентрировать патоген в исследуемом материале, что дает возможность повысить разрешающуюся способность экспересс-методов.
   
4. Результаты практического применения разработанных кампилобактериозных и листериозных МИБП, демонстрирующие повышение эффективности лабораторных исследований клинического и полевого материала.
   

^ Апробация работы. Диссертация обсуждена и одобрена на заседании Ученого совета ФГУЗ Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Роспотребнадзора, протокол № 3 от 15 мая 2007 года. Основные результаты диссертационной работы были представлены на научной конференции «Проблемы биологии и химии на Северном Кавказе», посвященной 70-летию биолого-химического факультета СГУ (Ставрополь, 2001); научной конференции Ставропольской медицинской академии (Ставрополь, 2002); международной научно-практической конференции «Биоресурсы, биотехнологии, инновации Юга России», 21-24 октября 2003 г. (Ставрополь-Пятигорск); научно-практической конференции «Опыт работы учреждений Роспотребнадзора в Ставропольском крае по обеспечению санэпидблагополучия и защите прав потребителей (Ставрополь, 2005);

II съезде военных врачей медико-профилактического профиля Вооруженных Сил Российской Федерации на базе Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова 15-17 ноября 2006 г. (Санкт-Петербург).

Основное содержание диссертации, выполненной в рамках 3 НИР, отражено в 37 научных публикациях.

^ Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы, приложений.

Она изложена на 245 страницах, содержит 24 таблицы и 28 рисунков. Список литературы включает 295 отечественных и 196 зарубежных литературных источников.

^ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы. В работе использованы 33 штамма микроорганизмов II, III, IV групп патогенности родов: Campylobacter, Listeria, Yersinia, Salmonella, Vibrio, Staphylococcus, Escherichia.

Использованы 35 кроликов породы «Шиншилла». При выполнении работы обследовано 800 человек (от них 920 проб), исследованы 931 проба от животных и птиц, 1005 проб из объектов внешней среды, в том числе 275 – пищевых продуктов, 280 – воды, 200 - почвы, 20 – сточных вод птицефабрик, 50 смывов с технологического оборудования и 20 проб промывных вод сырного производства.

Антигены микроорганизмов изолировали водно-солевой экстракцией с последующей ультразвуковой дезинтеграцией микробных клеток. Дезинтегрирование осуществляли на аппарате УЗДН -2Т (Россия).

Иммунизацию животных проводили с применением иммунокорректоров тималина, циклофосфана и тимогена. Контроль титра специфических антител в сыворотках определяли в непрямой реакции иммунофлуоресценции по T.H.Weller, A.H.Coons (1954). Для осаждения белков использовали сульфатный метод (Русанов В.М., Скобелев Л.И., 1980); метод фракционирования белковых смесей с использованием высокомолекулярного, незаряженного, линейного полимера – полиэтиленгликоля - 6000 (ПЭГ) по A.Polson и др. (1964). Иммуноглобулины также преципитировали каприловой (октановой) кислотой (Steibuch G., Andran R., 1969).

Количественное определение белка проводили по методу O.Warburg и W.Christian (1941) сравнением поглощения белков при 280 и 260 нм на спектрофотометре СФ-46 (Практическая химия белка, 1989).

Специфическую активность антигенов микроорганизмов и полученных иммунных сывороток определяли в реакции иммунодиффузии в 1 % агаровом геле (Difco, USA) по O. Ouchterlony (1949).

Конъюгацию иммуноглобулинов, фракционированных каприловой кислотой (Steibuch G., Andran R., 1974), с флуоресцеином изотиоцианатом (ФИТЦ) фирмы «Sigma» проводили по X.Шторц (Stortz, 1987). Прямой метод окраски препаратов осуществляли по A.H.Coons, M.H. Kaplan (1950). Очистку конъюгатов от непрореагировавшего флуорохрома осуществляли методом восходящей хроматографии на бумаге (Носков Ф.С., 1985).

Иммунопероксидазные конъюгаты получали методом перйодатного окисления по Р.К.Nakane, А.Kawaоi (1974) в модификации Е.А.Ткаченко с соавт. (1982). Рабочий титр и специфическую активность конъюгатов определяли по методике M.Clark и A.Adams (1977) в “сэндвич”- варианте ИФА. Очистку конъюгатов от несвязавшихся иммуноглобулинов и фермента проводили на хроматографической колонке фирмы LKB, используя сефадекс G-100.

Микроструктуру поверхности магносорбентов (МС) определяли на сканирующем электронном микроскопе (1М2-Т3000, Япония) по методу, описанному в работе Д.Фрайфелдера (1980), удельную поверхность МС - по методу А.А.Клячко-Гурвича (1961), основанному на низкотемпературной адсорбции азота. Суммарный объем и радиус пор определяли по методу Н.В.Кельцева (1984). Количественный иммунофлуоресцентный анализ проводили по методу К.Г.Стоева, В.А.Чибисовой, К.Л.Шаханиной (1981).

Сублимацию проводили в камерах TG-5 (Германия) и LZ-9c (Чехия).

Математическую обработку результатов экспериментов осуществляли на компьютере (программа EXCEL). Для подтверждения достоверности результатов, полученных при исследовании, применяли статистические методы (Тамбовцев Е.П., Ахметкалиев С.Г., Пятницкий Н.П., 1969; Скуч Д., Уэст Д., 1979).

^ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Конструирование питательных сред для кампилобактерий

и листерий

Взяв за питательную основу мелассу свекловичную, мы сконструировали транспортную, селективные и накопительные питательные среды, в которых учтены биологические особенности кампилобактерий и листерий. Транспортная среда для кампилобактерий и листерий представляет собой основу, содержащую 0, 05% тиогликолята натрия и 0,025 % цистеина. Селективная среда для листерий, кроме основы, содержит агар- агар микробиологический (15 г/л), дрожжевой экстракт ( 5 г/л ), глюкозу ( 1 г/л ), глицерин безводный (10,0 г/л), лецитин соевый (1,0 г/л) и антимикробную добавку: полимексин М ( 3 мг/л ), амфоглюкамин В ( 5 м/г ), цефазолин ( 30 мг/л ), колимицин ( 30 мг/л). Селективная среда для кампилобактерий дополнительно содержит эритрит, гемолизированную кровь барана или лошади (7 %) и аэ-

ротолерантную добавку (железо сернокислое, железо закисное, натрий пировинограднокислый по 0,025 %).

Для изготовления накопительных сред ( для наращивания биомасс микроорганизмов) взята рецептура селективных сред без антимикробной добавки, в которую введен стимулятор роста – «ЭСРМ» (7±1) мг/л. Этот универсальный стимулятор роста был разработан и с успехом применен при наращивании биомассы L.monocytogenes штамма АУФ при производстве листериозной вакцины (Панова Н.В., 2006). В препарате использовано сочетание биологических потенций куриного яйца и эмбриональной ткани, которые имеют наличие широкого набора составных частей, обладающих положительным катализирующим действием на метаболизм бактерий.

В сериях опытов при засеве 100 м.к. C.jejuni 1/NCTC 11168, C.coli 602, L.monocytogenes сероваров 1/2а и 4а на контрольных (глюкозо-глицериновый агар - для листерий, железоэритритный кровяной агар (ЖЭКА) – для кампилобактерий) при инкубации листерий при 37 ⁰С через 24-48 часов, а кампилобактерий – при 42 ⁰С в микроаэрофильных условиях через 48-72 часа наблюдался рост, типичный для каждого вида микроорганизмов. Количество выросших колоний на селективных средах при вычислении среднего показателя равнялось (85,3±1,4), а на накопительных – (93,8±1,83), в то время как в контролях среднее количество выросших колоний не превышало (73,2±2,1). На накопительных питательных средах показатель прироста бактериальной массы, вычесленный по формуле Э.М.Олиферовой (1998), в среднем составил (1,55±0,27) г/л, в то же время на контрольных средах он был ниже: на глюкозо-глицериновом агаре – (0,68±0,06), на ЖЭКА – (0,82±0,11) (таблица 1).

Консервирующую способность транспортной среды изучали в условиях комнатной температуры (22±2) ⁰С и холодильной камеры (4⁰С). При 4 ⁰С культуры кампилобактерий и листерий сохраняли жизнеспособность в течение 4 – 6 суток, а при (22±2) ⁰С – 3-4 суток. Достоинством этой среды является её пригодность для сохранения как кампилобактеров, так и листерий, что позволяет вести поиск этих микроорганизмов в одной и той же пробе.

Разработанные среды позволили успешно выделять патогены из материала от больных людей, животных, птицы, объектов внешней среды, а также для получения антигенов наращивать биомассы кампилобактерий и листерий в количествах, достаточных для этих целей.

^ Таблица 1. Сравнительное изучение ростовых свойств опытных и

контрольных питательных сред

Вид питательной среды	Количество колоний, выросших при посеве 100 м.к. (M±m)
	L. monocytogenes			Campylobacter
	С е р и и п и т а т е л ь н ы х с р е д
	1	3	5	2	3	5
Селективные питательные среды	83,7 ± 1,4	84,5 ± 1,2	84,7 ± 1,3	88,2 ± 4,7	86,7 ± 3,2	84,5 ± 2,8
Накопительные питательные среды	91,2 ± 2,3	96,9 ± 4,2	93,7 ± 3,1	95,8 ± 2,4	94,5 ± 3,2	91,2 ± 1,9
Глюкозо-глицериновый агар	70,7 ± 1,08	68,9 ± 2,71	71,1 ± 1,92	-	-	-
Железоэритритный кровяной агар	-	-	-	71,8 ± 1,8	73,2 ± 2,1	72,9 ± 1,92

*Примечание: - статистически достоверные результаты (от Р<0,001 до Р<0,1).


Использование доступного, дешевого, непродовольственного сырья в качестве основы позволило значительно снизить себестоимость питательных сред и ускорить процедуру их приготовления, так как отпала необходимость проведения гидролиза продуктов животного происхождения, традиционно используемого при приготовлении сред.

^ Разработка биотехнологии получения листериозных и кампилобактериозных диагностикумов для реакции агглютинации и реакции непрямой гемагглютинации

Одним из доступных и простых методов индикации и идентификации возбудителей инфекционных заболеваний является реакция агглютинации. Качество агглютинирующей сыворотки зависит от высокоактивной схемы специфической иммунизации животных. Проведена серия экспериментов по отработке оптимальной схемы иммунизации с варьированием концентрации антигенов, способов, кратности и периодичности их введения. Для иммунизации животных использовали обеззараженные 1 % раствором формалина с последующим кипячением в течение одного часа двухсуточные агаровые культуры L.monocytogenes сероваров 1/2а, 1/2в, 3а, 4а, 4в, 5, 7, доведенные до концентрации 1х10⁹ м.к./мл по оптическому стандарту мутности ОСО 42-28-59-85, взятые в равных долях. Корпускулярным кампилобактериозым полигрупповым антигеном служили объединенные в равных пропорциях бакмассы из C. jejuni 1/NCTC 1168, 33291, C. coli 602, C. fetus 322, обработанные при 100⁰С в течение одного часа с добавлением 1 % раствора формалина, доведенные до концентрации 1х10⁹ м.к./мл.

Наиболее результативной оказалась схема иммунизации, предусматривающая три способа введения антигена: внутривенный, в подушечки лап, в лимфатические узлы. Важным достоинством этой схемы является непродолжительность периода иммунизации кроликов-продуцентов, который составляет 17-18 дней, атравматичность для них, получение высоких титров специфических антител – до 1:3200 – 1:6400. Кампилобактериозные полигрупповые сыворотки для РА оказались высокоспецифичными, в то же время полученные листериозные агглютинирующие сыворотки давали в низких титрах перекрестные реакции с гетерологичными культурами (сальмонеллами, шигеллами, стафилококками). Специфичные полигрупповые листериозные сыворотки удалось получить после проведения иммуносорбции с помощью твердофазных ПААГ – сорбентов (таблица 2).

Традиционным и эффективным методом диагностики инфекционных заболеваний является реакция агглютинации с применением корпускулярного диагностикума. При окраске микробных клеток анилиновыми или други-

^ Таблица 2. Результаты сравнительного изучения специфической

активности и специфичности полигрупповых агглю-

тинирующих адсорбированных листериозных и

кампилобактериозных сывороток

№ пп	Наименование штаммов микроорганизмов	Листериозные сыворотки			Кампилобактериозные сыворотки
		Схемы иммунизации
		I	II	III	I	II	III
1	2	3	4	5	6	7	8
1.	L. monocytogenes 1/2a	1:6400	1:3200	1:6400	Специфическая агглютинация отсутствует
2.	L. monocytogenes 1/2в	1:3200	1:3200	1:6400
3.	L. monocytogenes 3а	1:3200	1:3200	1:6400
4.	L. monocytogenes 4а	1:3200	1:6400	1:6400
5.	L. monocytogenes 4в	1:3200	1:3200	1:6400
6.	L. monocytogenes 5	1:3200	1:6400	1:3200
7.	L. monocytogenes 7	1:6400	1:6400	1:6400
8.	Campylobacter jejuni 1/NCTC 11168	Специфическая агглютинация отсутствует			1:6400	1:3200	1:6400
9.	C. jejuni 33291				1:3200	1:6400	1:6400
10.	C. coli 602				1:3200	1:3200	1:3200
11.	C. fetus 322				1:3200	1:3200	1:3200
12- 14	Yersinia enterocolitica 178, 64, 383(9)	Специфическая агглютинация отсутствует
15- 17	Shigella dusenteriae 1954, Sh. flexneri 1250, Sh. Sonnei 396
18.	Vibrio cholerae eltor 5695, Ogawa
19.	V. cholerae cholerae M-143, Ogawa
20-21	Salmonella typhi 818,4446
22-23	Staphylococcus epidermidis, Staph.ACCT 25923
24.	Salmonella typhimurium 25M
25.	Salm.typhiabdominalis 7407
26-27	Escherichia coli 010,011
28-33	Yersinia pseudotuberculesis 1-6 серотипы

ми красителями реакция становится наиболее наглядной. Нами разработана биотехнология изготовления полигрупповых диагностикумов цветных листериозного и кампилобактериозного для реакции агглютинации. Из 12 испытанных красителей (малахитовый зеленый, бромкрезоловый синий, бромфеноловый синий, метилен виолет, фуксин кислый, фуксин основной, кристалл виолет, феноловый красный, тиомин синий, трепан синий, метилен синий, бриллиантовый зеленый) наиболее пригодным оказался бромфеноловый синий. Диагностикумы, окрашенные этим красителем, выявляли агглютинины в полигрупповых сыворотках для РА в разведении 1:1600 - 1:3200, при этом оптимальная концентрация микробной взвеси в нем – 3х10⁹ м.к./мл (таблица 3).

При изучении специфичности использовали коммерческие агглютинирующие сыворотки: сальмонеллезную поливалентную основных (АВСДЕ) групп, туляремийную агглютинирующую сухую, холерную «О», шигеллезную дизентерийную поливалетную, бруцеллезную поливалентную.