Разработка диагностической биочиповой тест-системы для одновременного выявления возбудителей трех клещевых инфекций: энцефалита, боррелиоза, риккетсиоза

Вид материала

Содержание

Основное содержание работы
Цель работы и основное результаты за отчетный период
Обсуждение результатов

Подобный материал:

«Разработка диагностической биочиповой тест-системы для одновременного выявления возбудителей трех клещевых инфекций: энцефалита, боррелиоза, риккетсиоза»

СПИСОК ИСПОЛНИТЕЛЕЙ ПРОЕКТА

Руководитель проекта:

Канд. биол. наук, с.н.с. Ю. П. Джиоев

Институт эпидемиологии и микробиологии

ГУ НЦМЭ ВСНЦ СО РАМН

Ответственные исполнители проекта:

Д-р биол. наук, профессор С. И. Беликов

Лимнологический институт СО РАН

Д-р. хим. наук, вед.науч.сотр. В. В. Анненков

Лимнологический институт СО РАН

Канд. биол. наук, старш. науч. сотр. Т. В. Демина

Институт эпидемиологии и микробиологии

Канд. биол. наук, старш. науч. сотр М. М. Верхозина

Институт эпидемиологии и микробиологии

Канд. хим. наук, старш. науч.сотр. Е. Н. Даниловцева

Лимнологический институт СО РАН

Канд. мед. наук , зав. лабораторией И. В. Козлова

Институт эпидемиологии и микробиологии

Канд. биол. наук, научн. сотрудник Р. В. Адельшин

Лимнологический институт СО РАН

аспирант Н. В. Анненкова

Лимнологический институт СО РАН

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение

Проект посвящен созданию генной диагностической системы для одновременного обнаружения возбудителей трех клещевых инфекций – вируса клещевого энцефалита (КЭ), бактерий клещевого боррелиоза (КБ) и клещевого риккетсиоза (КР) в одной пробе. В качестве основы новой тест-системы планируется использовать биочиповые технологии, позволяющие получать больший объем диагностической информации при упрощении и удешевлении анализа. Проект базируется на достигнутых в мировой практике нанобиотехнологиях, фундаментальных знаниях биомедицинских наук, а также на собственных исследовательских разработках в области структурного и функционального анализа химических и биологических соединений, являющихся сферой научных интересов авторов проекта. Создаваемые в рамках проекта биочиповые тест-системы не имеют аналогов на российском и мировом рынке, а развиваемый подход к их конструированию позволит создавать эффективные диагностикумы для других опасных инфекционных заболеваний.

Клещевые инфекции - энцефалит (КЭ), боррелиоз (КБ), риккетсиоз (КР) представляет собой опасные для человека инфекционные заболевания, передающиеся клещами. Возбудители этих инфекций распространены от Европы до стран Тихоокеанского региона, включая всю лесную территорию России. Число заболевших этими инфекциями в России исчисляется десятками тысяч в год, и эта проблема наиболее остра в нашем сибирском регионе. Одним клещом могут передаваться возбудители 2-х или 3-х инфекций одновременно, приводящие, даже при адекватной терапии, к тяжелому течению и развитию осложнений. Число заболевших только КЭ в год по Иркутской области в среднем за последние 5 лет достигало 450 человек, по КБ - более 250, а по КР диагностируется более 100 случаев. С каждым годом увеличивается как число клещей (на некоторых участках, например, на Байкальском тракте на 1 км маршрута выявляется до 500 - 800 клещей), так и число заболевших, причем, растет и количество заболевших одновременно 2-я или 3-я видами инфекции. Более 70 % заболевших клещевыми инфекциями являются жители городов и крупных поселков.

Важным этапом в профилактике и лечении клещевых инфекции является своевременная (в течение 1-2 дней) и достоверная постановка диагноза. Существующие способы диагностики основаны на обнаружении РНК или ДНК возбудителя методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) или антител к возбудителю методом иммуноферментного анализа (ИФА). В практике диагностических центров Иркутска обычно используется метод ИФА благодаря более низкой стоимости (150-200 руб./анализ) по сравнению с ПЦР (300-400 руб./анализ). В то же время, метод ИФА не имеет достаточной чувствительности и надежности при работе с малым количеством материала при выявлении специфических антигенов (собственно клещ, кровь и лимфа в начальной стадии заражения), при этом 10-20 процентов результатов получаются недостоверными. Выявление антител к возбудителям доступно только в поздние сроки заболевания.

По городу Иркутску количество диагностических анализов по каждому возбудителю клещевых инфекций превышает 10 тысяч в год. Денежный эквивалент этого рынка услуг на сегодня по г. Иркутску оценивается в более чем 10 млн. рублей, но спрос на такие услуги растет с каждым годом и в других городах Иркутской области.

Таким образом, становится необходимостью совершенствование методов диагностики, в первую очередь наиболее высоко информативной- генетическую диагностику, использующую ПЦР- метод. "Узким местом" многих коммерческих генно-диагностических методик является конечная стадия учета результатов ПЦР, в качестве которой используется электрофорез в геле, требующий достаточно дорогого оборудования и расходных материалов, высококвалифицированного персонала. В качестве альтернативного подхода, позволяющего в ряде случаев вообще обойтись без ПЦР, рассматривается метод генных биочипов, основанный на иммобилизации специфических олигонуклеотидов на твердых подложках. Нанесение на данные чипы исследуемого раствора, содержащего нуклеиновые кислоты с участками, комплементарными иммобилизованным на поверхности чипа олигонуклеотидам, приводит к специфическому связыванию (гибридизации). Это может фиксироваться с помощью флуоресцентных или радиоактивных меток, цветными иммуноферментными реакциями. К сожалению, несмотря на большое количество научных и патентных публикаций в этой области, в практическом здравоохранении биочиповые технологии не получили должного применения, во многом из-за чрезмерной увлеченности разработчиков миниатюризацией чипов, стремлением одновременно определять десятки или даже сотни нуклеиновых кислот, что закономерно приводит к резкому удорожанию регистрирующих систем и самих чипов.

Цель работы и основное результаты за отчетный период:

Целью настоящего проекта является разработка диагностической тест-системы на основе технологии биочипов для одновременного выявления в образцах различной природы возбудителей трех инфекций – вируса клещевого энцефалита, бактерии клещевого боррелиоза и клещевого риккетсиоза.

Обсуждение результатов

Проведенные исследования показали перспективность использования функционализированных нанорельефных покрытий для конструирования систем генной диагностики. Их использование позволяет значительно повысить интенсивность аналитического сигнала при детектировании полинуклеотидов методом гибридизации на твердой подложке. Полученный эффект достигается повышением (в 50-100 раз) эффективной поверхностной плотности иммобилизованного зонда в результате чего свечение люминесцентной метки может определяться при использовании достаточно небольшого увеличения микроскопа.

Дальнейшее развитие данной разработки должно быть направлено, прежде всего, на создание технологии нанесения функционализированного покрытия малой площади (0.2-0.5 мм²) и стандартизации этого процесса. Снижение площади покрытия позволит сконцентрировать весь определяемый продукт ПЦР на меньшей площади и, таким образом, еще увеличить яркость люминесценции. В то же время, размер пятна (Ø 0.5-1 мм) останется достаточно большим для работы без использования большого увеличения. Для достижения указанной цели необходимо приобретение специализированного дозатора, позволяющего с высокой точностью как по объему (0.1-0.5 мкл), так и по пространственным координатам дозировать растворы в лунки микробиологического планшета. Примером подобных дозаторов являются "Thermo Scientific Matrix Hydra II" (Thermo Fisher Scientific Inc, xtechcorp.com/automated/pipetting.aspx?id=25) и "Bravo Liquid Handling Platform" (Velocity11, ity11.com/instruments/bravo/overview_features).

На основании опыта, накопленного в процессе выполнения проекта, можно предложить следующий план работ по доведению разработки до уровня коммерческого внедрения:

1. Создание материально-технической базы для мелкосерийного выпуска модифицированных планшетов с использованием роботизированных дозаторов.

2. Расширенная апробация и оптимизация функционализированного покрытия и методики иммобилизации олигозондов.

3. Расширенные испытания модифицированных планшетов в реакции гибридизации.

4. Выпуск опытных партий диагностических наборов и их испытания в научных и лечебных учреждениях. Модификация, при необходимости, диагностических систем и методов их использования.

5. Маркетинговые исследования и мероприятия по защите интеллектуальной собственности.

Заключение

Работа над созданием нанобиочиповой системы одновременной диагностики трех клещевых инфекций, финансированной Департаментом инновационной деятельности, науки и высшей школы Иркутской области инновационному проекту "Разработка диагностической биочиповой тест-системы для одновременного выявления возбудителей трех клещевых инфекций: энцефалита, боррелиоза, риккетсиоза" завершена. Коллективу разработчиков и исполнителей этого проекта удалось реализовать в практическом аспекте поставленную цель и задачи по созданию конструкции нанобиочиповой системы одновременной диагностики возбудителей трех клещевых инфекций. В ходе работы были решены и изучены многие фундаментальные вопросы как из области нанохимии полимеров, так и молекулярной биологии возбудителей инфекционных заболеваний. Эти результаты были и будут отражаться в виде научных публикаций, научных докладов на представительных конференциях, в разработках новых грантовских проектов. Работа над совершенствованием и созданием новых модификационных вариантов нанобиочиповой системы диагностики не только возбудителей инфекционных заболеваний будет продолжаться. Преимущество разработанной конструкции нанобиочипа в том, что он универсален по своим технологическим возможностям. Эту конструкцию биочипа можно модифицировать под любую структуру носителя генетической информации и соответственно диагностировать заданный тип источника и носителя заболеваний.

К концу завершения работы над биочиповой конструкцией была получена информация о положительном решении на выдачу патента РФ по заявке

№ 2005140450/04 [1]. В последующем будут готовится заявки на получение патентов на разработку мультиплексной ПЦР одновременного выявления трех клещевых инфекций различной генетической природы и создание нанобиочиповой диагностической конструкции с мультивариантными свойствами.

Руководитель проекта, исполнители проекта, администрация Института эпидемиологи и микробиологии ГУ НЦМЭ, Лимнологического института СО РАН и ГУ Центра медицинской экологии ВСНЦ СО РАМН искренно выражают свою благодарность за понимание актуальности исследуемой проблемы и помощь в ее реализации Департаменту инновационной деятельности, науки и высшей школы Иркутской области.

Руководитель проекта,