Прототипы сибиреязвенных вакцин на основе генно-инженерных бациллярных штаммов и синтезируемых ими антигенов 03. 00. 07 микробиология 03. 00. 15 генетика

Вид материала

Документы

Содержание Научные консультанты Официальные оппоненты Ведущая организация Bacillus anthracis Задачи исследования B. anthracis B. anthracis. Научная новизна исследования B. anthracis B. anthracis B. anthracis Ститпа-1 (км96) Bacillus anthracis Основные положения, выносимые на защиту B. anthracis B. anthracis B. anthracis Апробация работы. Структура и объем диссертации. Материалы и методы. ... Полное содержание

Подобный материал:

• Рабочая программа дисциплины «промышленная микробиология и биотехнология» Код дисциплины, 235.83kb.
• Методика эутоназии опытных животных 71 Изучение сравнительной иммунологической эффективности, 172.42kb.
• 11 клас Биология, 13.71kb.
• Рабочая программа генетика Код дисциплины по учебному плану опд ф. 6 для студентов, 274.5kb.
• Барыкина ольга серафимовна, 40.14kb.
• Задачи селекции : повышение урожайности сортов культурных растений, увеличение продуктивности, 105.58kb.
• Генетика Генетика, 18.18kb.
• Темы: общая генетика, генетика человека, медицинская генетика. Вопросы для самоподготовки., 39.67kb.
• Идентификация и внутривидовое типирование возбудителей сапа и мелиоидоза 03. 00., 750.11kb.
• Примерная программа дисциплины микробиология, вирусология, микробиология полости рта, 447.35kb.

На правах рукописи


Микшис Наталья Ивановна


прототипы сибиреязвенных вакцин

на основе генно-инженерных бациллярных штаммов

и синтезируемых ими антигенов


03.00.07 – микробиология

03.00.15 – генетика


автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук


Саратов – 2009


Работа выполнена в ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека


Научные консультанты:

Член-корреспондент Российской Академии

медицинских наук,

доктор медицинских наук, профессор Кутырев Владимир Викторович

Доктор биологических наук, профессор Попов Юрий Алексеевич

Официальные оппоненты:

Член-корреспондент Российской Академии

наук, доктор медицинских наук, профессор Пименов Евгений Васильевич

Доктор медицинских наук, доцент Бойко Андрей Витальевич

Доктор медицинских наук, профессор Швиденко Инна Григорьевна

Ведущая организация:

ФГУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт»


Защита состоится «_____» _________________ 2009 г. в ______ часов на заседании диссертационного совета Д 208.078.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора (кандидата) наук при ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

(410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46; e-mail: microbe@san.ru)


С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб».

Автореферат разослан ____________________ 2008 г.


Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук,

старший научный сотрудник А.А. Слудский


общая характеристика работы

Актуальность исследования

Bacillus anthracis – грам-положительный, спорообразующий микроорганизм, вызывающий опасное зооантропонозное инфекционное заболевание, поражающее восприимчивых животных и людей. Ежегодно практически во всех регионах мира регистрируются многочисленные случаи сибиреязвенной инфекции. Данные мониторинга за развитием эпидемической ситуации в России свидетельствуют о неуклонном росте неблагополучных по сибирской язве территорий (Онищенко Г.Г., 2008). Расширение нозоареала патогенного микроорганизма, способного длительно сохраняться и накапливаться в окружающей среде, может привести к увеличению эпидемических проявлений сибиреязвенной инфекции (Черкасский Б.Л. с соавт., 2002). Крупнейшая вспышка сибирской язвы в Зимбабве в 1978 – 1979 гг. охватила почти 10 тысяч человек и унесла около 450 жизней (Davies J., 1982, 1983, 1985). В России в период с 2003 по 2007 гг. было зарегистрировано 43 подтвержденных случая заболевания сибирской язвой людей, из них 3 - с летальным исходом (Государственный доклад, 2007; Онищенко Г.Г., 2008). Повышение уровня заболеваемости отмечалось в 2004 году - 16 случаев в 5 областях Российской Федерации (Ясинский А.А. с соавт., 2005).

Высокая патогенность сибиреязвенного микроба в сочетании с уникальной устойчивостью споровых форм к воздействию факторов внешней среды, ставят его в разряд крайне опасных биологических агентов, имеющих потенциальную угрозу применения в качестве оружия массового поражения (Spencer R., Wilcox M., 1993; Redmond C . et al., 1998; Spencer R., Lightfoot N., 2001). Осуществленная в 2001 году рассылка контаминированной спорами B. anthracis корреспонденции вызвала панику среди населения США и привела к гибели пяти человек от легочной формы заболевания (Jernigan J. et al., 2001; Bush L. et al., 2001; Brachman P., 2002).

В системе ветеринарных и медико-санитарных мер, направленных на обеспечение эпидемиологического благополучия по сибирской язве, центральное место принадлежит вакцинации сельскохозяйственных животных и людей. Наиболее длительный и напряженный иммунитет обеспечивают живые сибиреязвенные вакцины. Однократное подкожное введение одной дозы распространенной в мире ветеринарной вакцины B. anthracis Sterne 34F₂ защищает животных от заражения возбудителем сибирской язвы в течение года (Turnbull P., 1991). В России живая вакцина на основе штамма B. anthracis СТИ-1 используется для профилактики сибирской язвы у людей. В практике ветеринарной медицины применяется штамм B. anthracis 55, полученный специалистами Всесоюзного научно-исследовательского института ве­теринарной вирусологии и микробиологии на основе природного бескапсульного изолята (Гаврилов В.А. с соавт., 1997). Существенным недостатком живых вакцин является относительно высокий уровень реактогенности (Turnbull P. et al., 1986; Ivins B. et al., 1990; Stepanov A. et al., 1996). Побочные эффекты связаны с воздействием на организм человека или животного токсичных продуктов жизнедеятельности вакцинных штаммов.

Рекомендованные для иммунопрофилактики живые вакцины получены в середине прошлого столетия классическими способами аттенуации вирулентных штаммов возбудителя сибирской язвы. В геноме B. anthracis присутствуют высокомолекулярные репликоны - pXO1 и pXO2 (Mikesell P. et al., 1983; Green B. et al., 1985; Uchida I. et al., 1985; Okinaka R. et al., 1999). В процессе аттенуации происходит элиминация плазмиды pXO2, детерминирующей синтез капсулы. В отсутствие капсулы сибиреязвенный микроб чувствителен к фагоцитозу и при попадании в макроорганизм не способен реализовать свой патогенный потенциал. Плазмида pXO1 содержит детерминанты, кодирующие синтез протективного антигена (ПА), отечного и летального факторов, входящих в состав экзотоксина бинарного действия. Отечный и летальный факторы, взаимодействуя с протеолитически активированным ПА, формируют токсичные комплексы, вызывающие структурные и функциональные изменения в восприимчивом организме (Leppla S., 1991). Вместе с тем, иммуногенный потенциал ПА сибиреязвенного микроба послужил основанием для создания на его основе химических вакцин.

Используемые в США и странах Западной Европы химические вакцины ввиду особенностей технологии получения их компонентов из аттенуированных культур B. anthracis, неизбежно содержат минимальные примеси отечного и летального факторов (Turnbull P. et al., 1991). Именно с данными продуктами связывают аллергические реакции, возникающие почти у 30 % вакцинированных в США людей (National communicable disease center, 1970; Swanson-Biearman B., Krenzelok E., 2001). Бесклеточные вакцины индуцируют выработку антител в высоких титрах и в ранние сроки, но для поддержания напряженного иммунитета необходимо проведение ревакцинаций.

В России для специфической профилактики сибирской язвы у людей и животных разработана также комбинированная вакцина, представляющая собой композицию спор вакцинного штамма B. anthracis СТИ-1 и бесклеточного препарата ПА адсорбированного на геле гидроокиси алюминия (Садовой Н.В. с соавт., 1998; Кожухов В.В. с соавт., 2002).

Достижения биологической и медицинской наук за последние несколько десятилетий изменили представления о средствах специфической профилактики инфекционных болезней. Развитие иммунологии, генетики и биохимии позволило приблизиться к разгадке тайн природы о клеточных и молекулярных механизмах взаимодействия макро- и микроорганизмов. В этих условиях аттенуированные штаммы утрачивают свою актуальность. В конструировании вакцин нового поколения на первый план выходят рекомбинантные технологии.

Кодирующий синтез ПА ген pag клонировали в штаммах различных бактериальных видов: Escherichia coli (Алимов А.П., Павлов В.М., 1995; Vodkin M., Leppla S., 1983; Gupta P. et al., 1999; Chauhan V. et al., 2001); B. subtilis (Тедиков В.М., Добрица А.П., 1993; Ivins B., Welkos S., 1986; Baillie L. et al., 1998(а)); B. anthracis (Barnard J., Friedlander A., 1999; Cohen S. et al., 2000); Francisella tularensis (Дармов И.В. с соавт., 1999); Salmonella typhimurium (Coulson N. et al., 1994; Garmory H. et al., 2003; Stokes M. et al., 2007) и Lactobacillus casei (Zegers N. еt al., 1999). В качестве экспрессирующих систем предлагались также вирусы (Iacono-Connors L. et al., 1991) и трансгенные растения (Azhar A. et al., 2002; Hull A. et al., 2005; Chichester J. et al., 2007). Однако далеко не во всех случаях удалось решить проблемы стабилизации гибридных молекул и оптимизации параметров экспрессии клонированных генов.

Отвечающие современным требованиям профилактические препараты должны разрабатываться с учетом всего арсенала накопленных знаний о структуре, свойствах, молекулярной природе, генетической детерминации, путях синтеза и регуляции факторов патогенности и иммуногенности инфекционного агента. Все вышеизложенное определяет актуальность планируемой диссертационной работы,

целью которой является: разработка комплексного подхода к созданию средств специфической профилактики сибирской язвы на основе рекомбинантных технологий.

Задачи исследования:

1. На основании экспериментальных данных о факторах иммуногенности и патогенности возбудителя сибирской язвы хромосомной детерминации создать коллекцию оптимальных реципиентов для генетического конструирования штаммов-продуцентов биологически-значимых антигенов сибиреязвенного микроба.
   
2. Сконструировать стабильные авирулентные рекомбинантные штаммы-продуценты протективного антигена B. anthracis. Оценить эффективность продукции протективного антигена штаммами с клонированным геном pag.
   
3. Разработать условия безопасной и экологичной технологии получения протективного антигена сибиреязвенного микроба. Сконструировать стабильный аспорогенный рекомбинантный штамм-продуцент протективного антигена, перспективный для производства основного компонента химических сибиреязвенных вакцин.
   
4. Оптимизировать экспериментальную схему выделения и очистки протективного антигена, синтезируемого генно-инженерным продуцентом. Получить высокоочищенный препарат рекомбинантного протективного антигена, осуществить его биохимическую и иммунохимическую характеристику. В экспериментах in vivo показать возможность применения рекомбинантного протективного антигена для осуществления специфической профилактики сибирской язвы.
   
5. Оценить иммуногенный потенциал белков S-слоя B. anthracis. Получить эффективные продуценты экскретируемого компонента S-слоя. Выделить, очистить, идентифицировать и охарактеризовать протеины Sap и ЕА1.
   
6. Изучить иммуногенность и остаточную вирулентность генно-инженерных штаммов в сравнении с лицензированными препаратами живых сибиреязвенных вакцин. Оценить перспективы рекомбинантных штаммов в плане создания на их основе менее реактогенных живых вакцин.
   
7. Определить основные направления использования генетически сконструированных штаммов и синтезируемых ими биологически значимых белковых продуктов.
   

Научная новизна исследования:

С учетом фундаментальных знаний о факторах патогенности и иммуногенности сибиреязвенного микроба и применением рекомбинантных технологий разработана комплексная экспериментальная система, включающая: а) протеазодефицитные и аспорогенные реципиентные штаммы B. anthracis; б) сконструированные на их основе стабильные, эффективные и безопасные продуценты иммуногенных антигенов; в) перспективные для создания ареактогенной химической вакцины препараты протективного антигена и компонентов S-слоя; г) генно-инженерный штамм B. anthracis, являющийся прототипом менее реактогенной живой сибиреязвенной вакцины.

Впервые получены стабильные и эффективные генно-инженерные продуценты ПА на основе бесплазмидных производных отечественных вакцинных штаммов B. anthracis СТИ-1 и B. anthracis 55.

Разработаны условия безопасной и экологичной технологии производства химической сибиреязвенной вакцины. Сконструирован не образующий спор стабильный рекомбинантный авирулентный штамм B. anthracis, продуцирующий ПА в 4 - 5 раз больше, чем вакцинные штаммы B. anthracis СТИ-1 и B. anthracis 55. Установлено, что двукратная иммунизация кроликов дозой 50 мкг очищенного препарата ПА, выделенного из аспорогенного рекомбинантного штамма B. anthracis 55TПА 1Spo^-, обеспечивает защиту 100 % животных от заражения 50 ЛД₅₀ высоковирулентного штамма B. anthracis 81/1.

В экспериментах на лабораторных животных показана перспективность использования рекомбинантного штамма B. anthracis СТИТПА-1 для создания менее реактогенной и эффективной живой сибиреязвенной вакцины. Однократная иммунизация морских свинок дозой 5  10⁷ спор сконструированных штаммов B. anthracis СТИТПА-1 и В. subtilis WB600ПА-1 вызывает развитие иммунного ответа, характеризующегося высокими значениями индексов иммунитета и титров антител к протективному антигену. Генно-инженерные штаммы не обладают остаточной вирулентностью для морских свинок и мышей линии BALB/с.

Впервые у штаммов возбудителя сибирской язвы обнаружены различия в продукции in vitro одного из белков S-слоя – Sap. Среди природных изолятов и аттенуированных производных B. anthracis обнаружены культуры, не продуцирующие Sap в среду выращивания.

Показано, что условия температурной элиминации плазмид в лабораторных условиях способствуют возникновению спонтанных Sap^- мутаций.

На основании изучения вирулентности изогенных производных B. anthracis 81/1 установлено, что спонтанные мутации, приводящие к сочетанному нарушению протеолитической, гемолитической активности, пигментсинтеза и пигментсорбции не вызывают значительного изменения патогенности штаммов B. anthracis. Спонтанные мутации, приводящие к смене фенотипа со спорообразующего на аспорогенный, сопровождаются снижением почти на два порядка степени патогенности штамма для беспородных белых мышей. Результаты изучения вирулентности спонтанных аспорогенных мутантов, инсерционного Spo^- мутанта и сконструированного Spo⁺ трансдуктанта свидетельствуют о влиянии на патогенность продуктов генов, находящихся в непосредственной близости от генов spo оперона или в функциональном взаимодействии с ними.

В основу эффективной селекции протеазодефицитных и аспорогенных штаммов B. anthracis положена выявленная корреляция экспрессии хромосомных признаков - протеолиза, гемолиза, пигментсорбции, пигментсинтеза и спорообразования.

Научная новизна и приоритетность выполненных исследований подтверждена 7 патентами Российской Федерации на изобретения: № 2321628 - рекомбинантный штамм B. anthracis СТИТПА-1 (pUB110PA-1) - продуцент протективного антигена сибиреязвенного микроба; № 2321629 - аспорогенный рекомбинантный штамм B. anthracis 55DТПА-1 Spo^- (pUB110PA-1) - продуцент протективного антигена сибиреязвенного микроба; № 2180349, № 2180916, № 2180917 и № 2180350 – аспорогенные штаммы B. anthracis, являющиеся продуцентами сибиреязвенных антигенов или реципиентами для генетического конструирования продуцентов сибиреязвенных антигенов; № 2193597 - способ получения аспорогенных штаммов B. anthracis.

Практическая ценность и формы внедрения:

В Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» депонирована система штаммов B. anthracis, необходимая для изучения генетической детерминации факторов патогенности и иммуногенности возбудителя сибирской язвы, направленного конструирования продуцентов биологически-значимых макромолекул, лабораторного и промышленного получения иммуногенных антигенов сибиреязвенного микроба. Она включает 25 бациллярных штаммов, в том числе: а) стабильные и эффективные рекомбинантные продуценты ПА сибиреязвенного микроба - B. anthracis СТИТПА-1 (КМ96), B. anthracis 55ΔТПА-1 (КМ95) и B. subtilis WB600ПА-1 (КМ199); б) аспорогенный рекомбинантный продуцент ПА - B. anthracis 55TПА-1Spo^- (КМ97); в) продуценты белка S-слоя (Sap) - B. anthracis Sterne H1 и B. anthracis 71/12H2 (КМ87 и КМ88); г) коллекцию реципиентных бесплазмидных штаммов для экспериментов по генетическому конструированию - B. anthracis 55T (КМ92(2)) и его аспорогенный мутант (КМ92(3)), аспорогенный мутант B. anthracis СТИT (КМ91), инсерционный аспорогенный мутант B. anthracis SterneT (КМ90), спонтанный и инсерционный Sap^- мутанты B. anthracis SterneT (КМ93 и КМ94); д) коллекцию из 11 изогенных штаммов B. anthracis - ди-, моно- и бесплазмидных производных B. anthracis 81/1 (КМ86(1-11)), различающихся по степени выраженности хромосомных признаков: протеолитической, гемолитической активности, способностей к сорбции и синтезу пигмента, спорообразованию; е) спонтанные аспорогенные мутанты вакцинных штаммов B. anthracis Sterne 34F₂ и B. anthracis 55 (КМ89 и КМ92).

Перечисленные штаммы использовались при выполнении НИР "Кон­ст­руи­ро­ва­ние рекомбинантных штаммов Bacillus anthracis для создания нового поколения высокоэффективных си­би­ре­яз­вен­ных вак­цин" (2001 - 2002 гг.), "Разработка и совершенствование средств и методов профилактики и лечения опасных и особо опасных заболеваний" (2002 - 2004 гг.) в рамках Федеральных целевых научно-технических программ: «Создание методов и средств защиты населения и среды обитания от опасных и особо опасных патогенов в чрезвычайных ситуациях природного и техногенного характера”, "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники". С применением депонированных штаммов проведены: хоздоговорная НИР с НИИ микробиологии МО РФ - "Получение аспорогенных производных вакцинных штаммов B. anthracis" (2000 г.), а также плановые НИР: "Изучение хромосомных факторов патогенности возбудителя сибирской язвы" (1997 - 2001 гг.), "Конструирование рекомбинантных штаммов Bacillus anthracis для создания нового поколения высокоэффективных сибиреязвенных вакцин" (2002 - 2004 гг.), «Использование препаратов протективного антигена и белков S-слоя для создания средств диагностики и профилактики сибирской язвы» (2006-2008 гг.). Аспорогенные штаммы B. anthracis (КМ89-92) применяются при проведении научно-технических разработок, проводимых в ФГУ «48 Центральный научно-исследовательский институт МО РФ» и ФГУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора».

Материалы диссертации вошли в практическое руководство «Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней», утвержденное руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (12.12.07 г.).

По материалам диссертации составлены методические документы, одобренные Ученым советом и утвержденные директором РосНИПЧИ «Микроб»: пособие для научных сотрудников - «Выделение в популяциях Bacillus anthracis фенотипов, различающихся по протолитической, гемолитической активности, способности к сорбции пигмента и спорообразованию» (30.04.99 г.); методические рекомендации - «Комплекс методических подходов к определению продукции протективного антигена сибиреязвенного микроба» (17.04.07 г.) и «Селекция штаммов сибиреязвенного микроба, продуцирующих белок Sap S-слоя» (27.06.07 г.).

Материалы диссертации представлены в лекционных циклах по генетике бактерий - на курсах специализации и повышения квалификации врачей и биологов при РосНИПЧИ «Микроб», на биологическом факультете Саратовского Государственного университета имени Н.Г. Чернышевского и биотехнологическом факультете Саратовского Государственного аграрного университета имени Н.И. Вавилова.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. С применением комплексного подхода, учитывающего дополнительные сведения о факторах иммуногенности и патогенности B. anthracis и использующего рекомбинантные технологии, создана экспериментальная система для конструирования сибиреязвенных вакцин. Ее компонентами являются: коллекция протеазодефицитных и аспорогенных бесплазмидных производных вакцинных штаммов B. anthracis; генно-инженерные бациллярные штаммы с высокой продукцией биологически активного протективного антигена, в том числе - стабильный аспорогенный продуцент; очищенные препараты рекомбинантного протективного антигена и белков S-слоя сибиреязвенного микроба; высокоиммуногенный штамм B. anthracis с клонированным геном pag.
   
2. Рекомбинантные штаммы B. anthracis СТИТПА-1, B. anthracis 55ΔТПА-1 и B. subtilis WB600ПА-1 - безопасные, стабильные и эффективные продуценты протективного антигена сибиреязвенного микроба. Генно-инженерные штаммы не содержат детерминанты синтеза основных факторов вирулентности возбудителя сибирской язвы, сохраняют биологические свойства при пассировании в селективных условиях и секретируют в пять раз больше иммуногенного антигена, чем вакцинные культуры B. anthracis СТИ-1 и B. anthracis 55.
   
3. Генно-инженерные штаммы с гибридным репликоном pUB110PA-1 обладают высокой иммунологической эффективностью. Однократная иммунизация биомоделей (мышей линии BALB/с, морских свинок) дозой 3 - 5  10⁷ спор рекомбинантных штаммов B. anthracis СТИТПА-1и B. subtilis WB600ПА-1 вызывает развитие напряженного иммунитета с высокими значениями титров антител к протективному антигену и эффективно защищает от заражения тест-штаммом возбудителя сибирской язвы.
   
4. Рекомбинантный аспорогенный штамм B. anthracis 55DТПА-1(Spo^-) при пассировании in vitro не реверсирует к спорообразующему фенотипу и в селективных условиях сохраняет способность к репликации гибридной плазмиды, определяя концепцию экологичной и безопасной технологии производства химической сибиреязвенной вакцины. Генно-инженерный штамм синтезирует биологически активный протективный антиген - двукратная иммунизация дозой 50 мкг очищенного рекомбинантного продукта обеспечивает защиту 100 % кроликов от заражения 50 ЛД₅₀ высоковирулентного штамма возбудителя сибирской язвы.
   
5. Белки S-слоя B. anthracis являются дополнительными факторами иммуногенности хромосомной детерминации на основании изучения протективных свойств очищенных белковых препаратов и изогенных Sap⁺ и Sap^- штаммов B. anthracis. Спонтанные или индуцированные мутации в штаммах B. anthracis, приводящие к смене фенотипа со спорообразующего на аспорогенный, сопровождаются снижением на 1 - 3 порядка степени их патогенности для белых мышей.
   

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и представлены на международных конференциях: 3-й международной конференции по сибирской язве (Плимут, Великобритания, 1998), 2-ой международной конференции по молекулярной биологии Bacillus cereus, Bacillus anthracis и Bacillus thuringiensis (Таос, Нью-Мексико, США, 1999), 1-ой международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2004), VI Межгосударственной научно-практической конференции «Санитарная охрана территорий государств-участников СНГ: проблемы биологической безопасности и противодействия биологическому терроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005), Межгосударственной научно-практической конференции «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (Саратов, 2007); на Российских конференциях: 2-ой Всероссийской конференции «Гомеостаз и инфекционный процесс» (Саратов, 1998); Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология - ХХI век» (Саратов, 2004); IX Всероссийской научно-практическая конференция «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2004); ХХ Российской конференции по электронной микроскопии (Черноголовка, 2004); Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» (Суздаль, 2005); Российском медицинском форуме «Фундаментальная наука и практика» (Москва, 2006); IX съезде всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007); а также на юбилейной научной конференции, посвященной 70-летию НИИ микробиологии МО РФ (Киров, 1998) и ежегодных научных конференциях РосНИПЧИ «Микроб» (Саратов, 2000-2008).

Публикации. Основное содержание работы отражено в 48 научных публикациях, из которых 12 статей в рекомендованных ВАК изданиях, 16 тезисов в сборниках международных и Российских конференций, 7 патентов.

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, списка принятых обозначений и сокращений, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 66 отечественных и 250 зарубежных источников. Общий объем диссертации составляет 297 страниц машинописного текста. Текст иллюстрирован 47-ю рисунками.