Идентификация и внутривидовое типирование возбудителей сапа и мелиоидоза 03. 00. 07 микробиология 03. 00. 15 генетика
| Вид материала | Автореферат |
- Контрольная работа по дисциплине Микробиология По теме Общая и специальная микробиология, 208.97kb.
- Рабочая программа генетика Код дисциплины по учебному плану опд ф. 6 для студентов, 274.5kb.
- Выделение и идентификация нетуберкулезных микобактерий у пациентов фтизиатрических, 706.97kb.
- Генетика Генетика, 18.18kb.
- Программа элективного курса по биологии для учащихся 10-х классов химико-биологического, 154.46kb.
- Разработка лабораторных экспресс-методов и технологии производства иммунодиагностических, 571.84kb.
- Темы: общая генетика, генетика человека, медицинская генетика. Вопросы для самоподготовки., 39.67kb.
- Примерная программа дисциплины микробиология, вирусология, микробиология полости рта, 447.35kb.
- Молекулярные механизмы формирования множественной лекарственной резистентности у Burkholderia, 787.44kb.
- Прототипы сибиреязвенных вакцин на основе генно-инженерных бациллярных штаммов и синтезируемых, 655.67kb.
| Для каждой пары праймеров подобраны оптимальные буферные растворы, концентрации дезоксинуклеозидтрифосфатов, ионов Mg2+ и Taq-полимеразы, а также режимы ПЦР. При оптимизации параметров реакции амплификации с ДНК исследуемых буркхольдерий синтезировались чёткие единичные специфические ампликоны (рис.2). Эти результаты соответствовали расчетным данным, которые были получены с помощью компьютерного анализа и свидетельствовали о потенциальной пригодности выбранных нами праймеров для конструирования амплификационных тест-систем с целью идентификации B.pseudomallei и B.mallei. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21  Рис. 2. Электрофореграмма продуктов реакции амплификации фрагментов генов 23S рРНК, fliC и orf13 B. pseudomallei, B. thailandensis и B. mallei. 1,21. Маркер молекулярных масс (леддер 100 -1000 п.н.)
При анализе чистых культур наибольшая чувствительность реакции амплификации отмечена с праймерами Burk3s/Burk4as, b23s7/b23a8 и bfl1s/bflas2 (1х102 м.к./мл), а наименьшая с олигонуклеотидными затравками М23-2/CVMP23-1 (1х105 м.к./мл). Чувствительность праймеров Bps16S-U33 /Bps16S-OL731 и b23s7/Burk4as составила 1х104м.к./мл, а остальных исследуемых олигонуклеотидных праймеров - 1х103м.к./мл. Для повышения чувствительности реакции амплификации нами апробирована 2-х раундовая («гнездовая») ПЦР. В первом раунде использовали праймеры burk3s/burk4as. Во втором раунде реакции для обнаружения возбудителей сапа и мелиоидоза применяли праймеры b23s7/b23a8, фланкирующие фрагмент размером 266 п.н., находящийся внутри участка гена 23S РНК, синтезируемого с помощью праймеров burk3s/burk4as. В результате исследований с помощью «гнездовой» ПЦР на чистых культурах патогенных буркхольдерий удалось повысить чувствительность реакции до 101 м.к./мл. Однако, при оценке специфичности сконструированных нами праймеров лишь три олигонуклеотидные затравки bfl1s/bfl2a, BTTS-s1/BTTS-as3 и b23s7/b23a8 обеспечивали специфическую детекцию возбудителей сапа и мелиоидоза. С олигонуклеотидными затравками burts1/burta2 положительный результат реакции амплификации зарегистрирован с ДНК триады буркхольдерий - B.mallei, B.pseudomallei и B.thailandensis. При анализе гетерологичных микроорганизмов, в том числе бактерий комплекса B.cepacia и мелиоидозоподобных почвенных микроорганизмов (Ленкоранских штаммов) специфических фрагментов амплификации не выявлено. На основе этих четырех пар олигонуклеотидных затравок нами сконструированы четыре монолокусные амплификационные тест-системы с детекцией продуктов амплификации методом электрофореза. От всех других пар праймеров нам пришлось отказаться. В отдельных случаях это было обусловлено их относительно низкой чувствительностью, отсутствием специфических ампликонов при анализе ДНК некоторых штаммов B.pseudomallei, а также ввиду наличия ложноположительных результатов при исследовании гетерологичного микроорганизма – B.cepacia, хотя все разработанные праймеры показали свою пригодность при компьютерном анализе. При секвенировании фрагментов, включающих места посадки праймеров, нами выявлено несколько нуклеотидных замен в штаммах B.cepacia 8235 и 3181, которые послужили основой для формирования ложных результатов ПЦР. При определении специфичности праймеров burk1s/burk2as и burk3s/burk2as нам не удалось дифференцировать с их помощью возбудители сапа и мелиоидоза. Этот вариант реакции обладал только группоспецифической активностью, детектируя все штаммы возбудителя сапа и часть штаммов возбудителя мелиоидоза. Полученные результаты свидетельствовали о том, что результаты компьютерного анализа и исследования «in silico» целесообразно рассматривать как весомые, но ориентировочные данные, и для пригодности выбранных праймеров всегда необходимы исследования с широким набором как гомологичных, так и гетерологичных видов микроорганизмов. Для оценки диагностической ценности тест-систем для выявления патогенных буркхолдерий нами проведены комиссионные испытания трех пар праймеров - bfl1s/bfl2a, BTTS-s1/BTTS-as3 и b23s7/b23a8. Материалом для исследования служили 30 проб взвесей чистых культур возбудителей сапа и мелиоидоза - Burkholderia mallei (5 штаммов), Burkholderia pseudomallei (5 штаммов) с различной концентрацией клеток, также как и 22 пробы гетерологичных микроорганизмов - B. thailandensis (5 штаммов), B. сepacia (9 штаммов), Brucella abortus, Brucella melitensis, Brucella suis, Brucella ovis, Francisella tularensis, Yersinia pestis, Vibrio cholerae, Bacillus anthracis (по одному штамму), 60 проб объектов внешней среды (вода, смывы), искусственно инфицированных Burkholderia mallei и Burkholderia pseudomallei и 46 проб, искусственно инфицированных гетерологичными видами микроорганизмов. С данными тремя парами праймеров результаты исследований оказались идентичными. Из 30 исследованных проб чистых культур B.mallei и B.pseudomallei в дозах от 1х102 до 1х104 м.к./мл, положительные реакции выявлены в 26 пробах (86,6 %), в том числе при концентрациях не ниже 103 м.к./мл – в 100 % проб. Из 60 исследованных проб объектов внешней среды (вода, смывы), инфицированных B.mallei и B.pseudomallei в дозах от 1х102 до 1х104 м.к./мл, положительные реакции выявлены в 52 пробах (86,6 %), в том числе при концентрациях не ниже 103 м.к./мл – в 100 % проб. При исследовании 23 проб чистых культур гетерологичных микроорганизмов и 46 проб объектов внешней среды (вода, смывы), зараженных гетерологичными микроорганизмами в дозах 1х107м.к./мл, неспецифических (ложноположительных) реакций не выявлено. Таким образом, три олигонуклеотидные затравки bfl1s/bfl2a, BTTS-s1/BTTS-as3 и b23s7/b23a8 обеспечивают детекцию трех различных генетических мишеней при идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза. Разработанные на их основе амплификационные тест-системы позволяют выявлять 100 % штаммов B.mallei и B.pseudomallei как в пробах чистых культур, так и пробах объектов внешней среды с пороговой чувствительностью 103 м.к./мл. 5. Использование ПЦР для выявления патогенных буркхольдерий при экспериментальной инфекции При создании амплификационных тест-систем первичный анализ параметров их качества проводится на чистых культурах как гомологичных, так и гетерологичных видов микроорганизмов, а также контаминированных возбудителями пробах из объектов внешней среды. Однако эти результаты не дают возможности объективно оценивать диагностическую эффективность ПЦР при инфекционном процессе, вызванном изучаемыми патогенами. В связи с этим, сконструированные нами тест-системы прошли апробацию в качестве диагностических средств при моделировании инфекционного процесса, вызванного заражением лабораторных животных как патогенными буркхольдериями, так и B.thailandensis. При сравнительном анализе эффективности ПЦР и культурального метода выявлено, что реакция амплификации при остром мелиоидозе и сапе оказалась результативнее бактериологического метода. Достоверность различий в диагностической эффективности ПЦР и бактериологического метода (p < 0,01) подтверждено статистическим анализом полученных результатов. Выявление возбудителей с использованием ПЦР оказалось эффективным уже в первые сутки после подкожного заражения вирулентным штаммом B. mallei 10230 и B.pseudomallei 100 (в инкубационном периоде), тогда как с помощью бактериологического метода патогенные буркхольдерии выделяли лишь с 3-их сут заболеваний (рис. 3). А   БРис. 3. Выявление возбудителей сапа и мелиоидоза с острой формой инфекции бактериологическим методом и ПЦР. Примечание: А – мелиоидоз, Б – сап; по оси ординат - % положительных результатов. В первые сутки наблюдения в реакции амплификации B.pseudomallei обнаруживали в 20 % образцов крови, 40 % образцов лимфатических узлов, в 20 % проб печени и селезёнки и в 10 % образцов легочной ткани, а B.mallei - в паховых лимфатических узлах (20 %), образцах печени (20 %) и в 20 % образцов крови. На 3 сутки исследования B.pseudomallei обнаруживали во всех исследуемых тканях в 100% случаев, а B.mallei – в лимфатических узлах (60%), в образцах печени (80%), селезёнки (60%), лёгких (80%). В крови зараженных животных ДНК возбудителя сапа на 3 сутки регистрировали при анализе 60 % проб, а возбудителя мелиоидоза - в 100 % случаев. Схожие данные получены R.L.Ulrich с соавторами (2006), которым также удалось обнаружить B. mallei методом ПЦР в легких, селезенке и печени через 24 ч после аэрозольного заражения мышей линии BALB/c. Известно, что мелиоидоз и сап могут протекать в различных формах с возможностью перехода из латентного и хронического в острое состояние и обратно. Бактериологический и биологический методы эффективны для диагностики острого сапа и мелиоидоза, но выделить возбудители при хроническом течении чаще всего не удается (Цветков Н.Е., Черняк В.З., 1947; Беляков В.Д., 1990). Выяснение особенностей персистенции патогенных буркхольдерий нами проведено в условиях хронизации процесса при экспериментальном заражении лабораторных животных. Хроническую форму мелиоидозной инфекции моделировали на морских свинках с помощью аэрогенного заражения низковирулентным штаммом B.pseudomallei 56770 - 99/10 (LD50 составляла 5х105 м.к.) (Алексеев В.В. c соавт., 2000). Для моделирования сапной инфекции с длительным течением использовали ауксотрофный мутант B.mallei Ц-4 1360 со сниженной вирулентностью (LD50 при подкожном заражении для золотистых хомячков составляла 1х107 м.к.) (Шиповская Н.П. с соавт., 1983). При использовании бактериологического метода на 3 сут после аэрогенного заражения культуру B.pseudomallei выделяли только из лёгких. Во всех остальных исследованных тканях мелиоидозный микроб обнаруживали с 20 сут вплоть до окончания срока наблюдения (38 сут). С помощью ПЦР на 3 сут после заражения, в отличие от бактериологического метода, B.pseudomallei обнаруживали в образцах лёгких, печени и селезёнки. При исследовании образцов крови, печени, селезёнки и лёгких культуральным методом положительные результаты были получены в 18% проб, а при применении ПЦР - в 33 % случаев. При сравнительной оценке эффективности бактериологического метода и ПЦР при хронической форме сапа также установлено статистически достоверное различие в диагностической эффективности этих двух методов (p<0,001). С помощью культурального метода сапной микроб обнаруживали лишь в 1 из 200 исследованных проб (0,5 %), в то время как в реакции амплификации ДНК возбудителя сапа детектировали в 75 пробах (37,5%) Используемые праймеры показали свою пригодность и высокую эффективность при диагностике различных форм инфекций, что явилось основанием для включения ПЦР в схему лабораторной диагностики сапа и мелиоидоза. При изучении персистенции B.thailandensis в организме зараженных лабораторных животных метод ПЦР, так же как и при подострых формах сапа и мелиоидоза, оказался более эффективным для обнаружения B.thailandensis. От морских свинок, зараженных B.thailandensis аэрогенно, в реакции амплификации с использованием праймеров burts1/burta2 положительные результаты получены в 53 из 75 (70,6%) случаях. С помощью бактериологического метода культура B.thailandensis выделена в 9 из 75 (12%) пробах. При секвенировании ампликонов, полученных при исследовании объектов внешней среды и проб экспериментального клинического материала, нами выявлена 100 % гомология с ДНК лишь возбудителей сапа и мелиоидоза. Однако для исключения возможных ложноположительных реакций и повышения специфичности идентификационных тестов необходимо использовать две ДНК мишени - участки 16S рРНК, 23S рРНК и orf13 или fliC. Сочетание реакции амплификации и последующего секвенирования фрагментов этих генов является алгоритмом ускоренной идентификации B.mallei и B. pseudomallei и их дифференциации от близкородственных видов без проведения этапа культивирования микроорганизмов. Учитывая, что проведение идентификации на основе культурально-морфологических и биохимических признаков занимает 2-3 дня, а общее время исследований с помощью молекулярно-генетических методов составляет порядка 9 часов, данный алгоритм вполне оправдан. Аналогичные рекомендации по использованию нескольких ДНК-мишеней (16S рРНК с дополнительным секвенированием гена 23S рРНК или спейсерной области 16S-23S рРНК) предложены и другими авторами для быстрой идентификации возбудителей особо опасных инфекций (Ruppitsch W. et al., 2007). 6. Совершенствование молекулярно-генетических методов внутривидового типирования возбудителей сапа и мелиоидоза Проблемы, связанные с недостатками фенотипических методов дифференциации штаммов патогенных буркхольдерий стимулировали развитие методов типирования, основанных на исследовании структуры их ДНК. Для молекулярного типирования штаммов возбудителя мелиоидоза, выделенных из окружающей среды, от человека и животных были использованы такие методы как полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (Yap E.H. et al., 1995), риботипирование (Desmarchelier P.M. et al., 1993; Sexton M.M., 1993; Trakulsomboon S. et al., 1997; Inglis T.J., et al., 2002; Grif K. et al., 2003 340, 353) и гель-электрофорез в пульсирующем электрическом поле (Vadivelu J. et al., 1997; Koonpaew S. et al., 2000; Cheng A.C. et al., 2005), а также RAPD (Haase A. et al., 1995) и МЛСТ (Godoy D. et al., 2003). Дифференциацию штаммов возбудителя сапа проводили с помощью пульс-электрофореза (Chantratita N. et al., 2006), ДНК-зондирования (Monastyrskaya G. et al., 2004; Fushan A. et al., 2005) и риботипирования (Harvey S.P., Minter J.M., 2005). Однако, публикаций, касающихся ускоренного определения штаммовой гетерогенности патогенных буркхольдерий крайне мало. По крайней мере, поиск генетических маркеров для быстрого генотипирования штаммов B.mallei продолжается вплоть до настоящего времени. Учитывая то, что в нашей коллекции отсутствовали штаммы возбудителей сапа и мелиоидоза, выделенные в период каких-либо вспышек заболеваний, в своей работе мы провели сравнительный анализ различных генотипических методов дифференциации коллекционных штаммов B.mallei и B.pseudomallei с целью установления степени сходства изучаемых культур и разработки оптимального алгоритма внутривидового типирования патогенных буркхольдерий. Из методов внутривидовой генетической дифференциации были использованы плазмидный анализ, монолокусное и мультилокусное-сиквенс типирование, схема типирования на основе вариабельных ампликонов, Rep-типирование, VNTR анализ и амплификация с различными произвольными праймерами. Все исследуемые методы оказались эффективными для дифференциации штаммов B.pseudomallei, но не для B.mallei, что связано с различной структурной и функциональной организацией геномов этих патогенов (Holden M.T. et al., 2004; Nierman W.C. et al., 2004). В результате проведенного плазмидного анализа нами оптимизирован метод скрининга плазмидных репликонов и выделено 4 типа штаммов В.pseudomallei, отличающихся по наличию плазмидных репликонов pPM1, рСМ2, рСМ3 и pCM4. В I группу отнесены штаммы, содержащие плазмиду рРМ1, II группу составляют штаммы с плазмидой рСМ2, в III группу входят штаммы рСМ3 и IV группу объединены штаммы с плазмидой pCM4. Плазмиды сохранялись в плазмидсодержащих штаммах в условиях длительного культивирования на питательных средах и пассажах на лабораторных животных, что свидетельствовало об их стабильном наследовании (Замараев В.С., 2004). На основе собственных и литературных данных (Jigen J., Li L., 1992; Radua S. et al., 2000) плазмидный анализ рекомендован в качестве генотипического метода дифференциации штаммов возбудителя мелиоидоза, в отличие от возбудителя сапа, в штаммах которого не обнаружены внехромосомные факторы наследственности не выявлены. Обнаруженные плазмиды могут выступать в качестве дополнительного критерия генотипической дифференциации штаммов и являться эпидемиологическим маркером в случае возникновении инфекционного процесса, вызванного плазмидсодержащим штаммом B.pseudomallei. При компьютерном анализе и секвенирования участков генов 16S рРНК, 23S рРНК и fliC нам необходимо было решить две задачи. С одной стороны, определить консервативные локусы среди различных видов буркхольдерий и гетерологичных микроорганизмов, на основе которых мы конструировали амплификационные тест-системы, а с другой – оценить вариабельность этих генов внутри видов B.mallei и B.pseudomallei. В случае выявления нуклеотидных замен в изучаемых генах, провести типирование патогенных буркхольдерий. Однако количество таких различий оказалось недостаточным для эффективного разделения штаммов патогенных буркхольдерий ввиду выраженной гомологии геномов возбудителей. В результате кластерного анализа 30-ти штаммов возбудителя мелиоидоза и 16-ти штаммов возбудителя сапа нам удалось сформировать 3 группы штаммов B. pseudomallei и две группы B. mallei на основе фрагмента гена 16S рРНК. При сравнении нуклеотидных последовательностей целого гена 16S рРНК B. pseudomallei и B.mallei сформировано 9 и 4 группы штаммов, соответственно. На основе нуклеотидных последовательностей этого гена проведено выделение буркхольдерий в самостоятельный род бактерий (Yabuuchi E. et al., 1992) и B.thaillandensis в отдельный вид (Brett P.J. et al., 1998), а также дифференциация возбудителя мелиоидоза от возбудителя сапа (Gee J.E. et al., 2003), что также было подтверждено при выполнении настоящей работы. При сравнении секвенированных последовательностей фрагментов 23S рРНК B. mallei и B. pseudomallei не обнаружено ни внутривидовых, ни межвидовых отличий, за исключением двух штаммов возбудителя мелиоидоза, выделенных в отдельную кластерную группу. Лишь при сравнении целого гена выявлены три нуклеотидные замены, на основе которых возможна дифференциация между собой этих двух видов микроорганизмов (Bauernfeind A. et al., 1998). Различий в нуклеотидных последовательностях fliC генов было еще меньше. При формировании 4 кластерных групп, образованных обоими видами буркхольдерий, штаммы возбудителя сапа вошли в одну группу с B.pseudomallei. Малое количество вариабельных последовательностей внутри выбранных генов патогенных буркхольдерий свидетельствовало о низкой эффективности этих ДНК-мишеней для генотипирования штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза, а также определяло необходимость использования дополнительных методов дифференциации. Одним из таких методов является метод мультилокусного секвенс-типирования, впервые предложенный D. Godoy с соавторами (Godoy D. et al., 2003) для генотипирования возбудителя мелиоидоза. Разрешающая способность МЛСТ нами оценена при анализе двух коллекционных штаммов B. mallei 10230 и V-120 и трех штаммов B. pseudomallei 100, С-141 и 107. Классификацию аллельного профиля изучаемых штаммов B.pseudomallei и B.mallei проводили путем сравнения полученных нами сиквенсов с известной базой данных МЛСТ (ссылка скрыта) на странице Burkholderia. Распределение аллелей исследуемых штаммов B. mallei и B.pseudomallei представлено в таблице 2. Таблица 2 Характеристика исследуемых штаммов патогенных буркхольдерий по сиквенс-типу
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||