«Челябинская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации»
Вид материала | Автореферат диссертации |
- Рабочая программа послевузовской профессиональной подготовки в клинической ординатуре, 1360.01kb.
- Рабочая программа профессиональной подготовки специалистов в клинической интернатуре, 981.3kb.
- Описторхозе у населения среднего приобья, 889.99kb.
- Золотухина лидия Валерьевна особенности психического здоровья врачей-психиатров с синдромом, 309.24kb.
- Школьников, 619.1kb.
- Клинико-морфологические аспекты в диагностике внутренних нарушений височно-нижнечелюстного, 476.63kb.
- На правах рукописи, 327.81kb.
- Р. Н. Мищенко Рекомендовано к печати редакционно-издательским советом Стгма, 118.58kb.
- Методика практико-ориентированного обучения врачей- курсантов фдппо, 975.62kb.
- Автореферат диссертации на соискание ученой степени, 466.52kb.
На правах рукописи
Конькова-Рейдман Алена Борисовна
ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКАЯ
И КЛИНИКО-ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИКСОДОВЫХ КЛЕЩЕВЫХ БОРРЕЛИОЗОВ
(МОНО- И МИКСТ-ИНФЕКЦИЯ С КЛЕЩЕВЫМ ЭНЦЕФАЛИТОМ)
В ЮЖНО-УРАЛЬСКОМ РЕГИОНЕ РОССИИ
14.02.02 – эпидемиология
14.01.09 – инфекционные болезни
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
доктора медицинских наук
Омск - 2011
Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации»
Научные консультанты:
доктор медицинских наук,
профессор, академик РАМН Злобин Владимир Игоревич
доктор медицинских наук,
профессор Ратникова Людмила Ивановна
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук Ястребов Владимир Константинович
доктор медицинских наук Козлова Ирина Валерьевна
доктор медицинских наук, Лепехин Алексей Васильевич
профессор
Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пермская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации»
Защита состоится «_____»_____________2011 г. в «______» часов на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д.208.065.03 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Омская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации» по адресу: 644043, Омск, ул. Ленина, 12; тел.(3812) 23-13-32.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Омской государственной медицинской академии
Автореферат разослан «______»_____________2011 г.
И.О. ученого секретаря диссертационного совета,
доктор медицинских наук, профессор В.А. Ширинский
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Природноочаговые инфекции, передающиеся иксодовыми клещами, такие как иксодовые клещевые боррелиозы (ИКБ), клещевой энцефалит (КЭ) и их микст-формы представляют серьезную проблему здравоохранения для большинства территорий Российской Федерации. На протяжении последней четверти ХХ века заболеваемость этими инфекциями неуклонно росла и достигла беспрецедентно высокого уровня (Злобин В.И., Горин О.З., 1996; Коренберг Э.И., 1996; Борисов В.А., 2002; Злобин В.И., 2010).
В пределах России находится значительная или даже большая часть мирового ареала B. burgdorferi sensu lato (Коренберг Э.И. и др., 1995). По мере улучшения диагностики показатели заболеваемости неуклонно приближаются к прогнозированной величине, которая составляет не менее 10-12 тыс. случаев в год. Наибольшее число случаев приходится на Урал, Западную Сибирь и Волго-Вятский регион (Коренберг Э.И., 2001; Ястребов В.К., Утенкова Е.О., 2010).
На территории России практически все очаги ИКБ и КЭ являются сочетанными. Районы интенсивного роста заболеваемости ИКБ в основном совпадают с зоной высокого риска заражения КЭ (Матущенко А.А., 2002; Вельгин С.О. и др., 2007; Козлова И.В., 2008; Баранова Н.С. и др., 2010). Показано нередкое наличие микст-форм при заражении двумя и более геновидами боррелий, а также боррелий в сочетании с вирусом КЭ. Удельный вес микст-инфекции среди больных с ИКБ составляет от 5 до 30% по данным разных авторов (Коренберг Э.И., 2002; Леонова Г.Н. и др., 2002; Оберт А.С. и др., 2001; Ястребов В.К., 2010). Имеются отдельные работы, которые затрагивают некоторые аспекты эпидемиологии клещевых моно- и микст-инфекций на территории Уральского региона (Волкова Л.И. и др. 2003; Колясникова Н.М., 2008 г.), но в них не проведен комплексный анализ, необходимый для выявления тенденций в динамике заболеваемости, определения ее структуры, клинических форм, прогноза и планирования противоэпидемических и лечебных мероприятий. Отсутствуют данные об уровне зараженности переносчиков возбудителями клещевых инфекций, в т.ч. микст-инфицированности, не известны генетическая структура возбудителей, современный ареал, процессы формирования антропоургических очагов. Не дана оценка влияния объемов и качества профилактических мероприятий на уровень заболеваемости, нет обоснований современных подходов к профилактике клещевых инфекций. Вместе с тем особую проблему составляют в настоящее время энцефалитно-боррелиозные микст-заболевания. В Екатеринбурге сочетание двух инфекций отмечено у 10,72,2% всех больных КЭ и ИКБ, что составляет 6,3 на 100 тыс. человек (Лесняк О.М., 1999), в Северо-Западном регионе России – в 15% наблюдений (Лобзин Ю.В., Усков А.Н., 2000); в Томской области от 25-30% до 40% случаев ИКБ протекает одновременно с КЭ (Лепехин А.В. и др.,2000; Ундинцева В.А. и др., 2010). Ряд авторов отмечает явление патоморфоза КЭ, различия в тяжести течения, преобладании определенных клинических форм, летальности в пределах нозоареала (Злобин В.И., 2006; Иерусалимский А.П., 2000; Волкова Л.И., Ковтун О.П., 2010; Захарычева Т.А., 2010; Толоконская Н.П. и др., 2010).
Если клинико-патогенетические аспекты моно-инфекции КЭ и ИКБ достаточно глубоко изучены, то механизмы взаимовлияния, интерференции и взаимоисключения при микст-инфекции (МИ) этих возбудителей остаются практически не исследованными. Вовлечение в процесс нервной системы при обеих инфекциях усложняет диагностику и изучение микст-инфекции (Лобзин Ю.В. и др., 2000; Деконенко Е.П. и др., 2002). К настоящему времени глубоко исследованы на системном и локальном уровне цитопатические проявления и апоптотические процессы при КЭ (Olsen C.W., Kehren J.C.,1999; Komatsu, Т., 1999; Boje K. et al., 2002). Практически не исследованы механизмы иммуноопосредованного воспаления при МИ. Интерес представляет анализ нарушений иммунного гомеостаза на системном уровне и в пределах ЦНС, в частности, популяционного и субпопуляционного спектра лимфоцитов, количественное изучение продуктов индуцированной секреции медиаторов воспаления, образуемых активированными клетками нервной ткани, макрофагальными элементами нейроглии (интерлейкины, оксид азота, комплемент, БТШ), что не исследовано при КЭ, микст-инфекции с ИКБ и собственно ИКБ, протекающих с преимущественным поражением нервной системы.
Секреторные продукты иммуноцитов, как показано в большом цикле работ различных авторов, несомненно, обладают нейромедиаторными и психотропными эффектами. На эмоциональную сферу человека оказывают влияние нейропептиды костного мозга и тимуса, установлена нейротрансмиттерная роль секреторных продуктов иммуноцитов: ИЛ-1, ИЛ-6, ИФН-(Кравцов А.Н. и др., 2004; Connor T.J.et al., 1998; Dinan T.G. et al., 1998; Segman R.H. et al., 2002). Наличие нейропсихологических изменений, выявленных у пациентов, перенесших клещевые инфекции, является одним из показателей завершенности процесса или его прогредиентности, поскольку с разрешением основного заболевания становится более благоприятным восстановление мнестических расстройств (Ерман Б.А., 2001; Иерусалимский А.П., 2003). При КЭ были отмечены мнестико-интеллектуальные и характерологические нарушения (Помогаева А.П., 2006; Надеждина М.В., 2007). До 54% реконвалесцентов, перенесших ИКБ, беспокоили снижение памяти и нарушение концентрации внимания, не имеющие объективного подтверждения, но отражающиеся на качестве жизни пациентов (Деконенко Е.П., 2005; Бондаренко А.Л. и др., 2006; Steere A.C., 1989; Logigan E.L., 1996). Однако, несмотря на проводимые исследования, психосоматические феномены при КЭ и ИКБ остаются недостаточно изученными, а при МИ – неизвестными.
Установлено изменение характера нитроксидергической регуляции на системном и локальном уровне при КЭ (Конькова А.Б., 2001), однако не исследованы эти процессы при микст-инфекции с ИКБ. Между тем усиление системной и локальной продукции NO может приводить к инициации процессов апоптоза, свободнорадикального окисления и требует патогенетически обоснованной медикаментозной коррекции. Указанные мотивы послужили основанием для проведения настоящей работы.
Цель исследования: на основании результатов комплексных эпидемиологических и клинико-иммунологических исследований установить региональные особенности этиологии, эпидемиологии, иммуноопосредованные механизмы патогенеза при различных клинических формах иксодовых клещевых боррелиозов (моно- и микст-инфекция с КЭ) на эндемичной территории Южного Урала, обосновать рациональные подходы к патогенетически ориентированной терапии.
Задачи исследования:
1) охарактеризовать основные эпидемиологические закономерности иксодовых клещевых боррелиозов, клещевого энцефалита, микст-инфекций в Южно-Уральском регионе;
2) осуществить сравнительный молекулярно-эпидемиологический анализ возбудителей клещевого энцефалита и иксодовых клещевых боррелиозов на территории Челябинской области;
3) выявить региональные этиологические и клинико-эпидемиологические особенности «клещевых» инфекций на территории Южно-Уральского региона России;
4) изучить клиническую характеристику «клещевых» инфекций, этиологически обусловленных различными патогенами, и их генетическими вариантами, микст-инфекции, вызванной сочетанным инфицированием вирусом КЭ и боррелиями;
5) изучить тип иммунного ответа на системном и локальном уровне, в том числе анализ нарушений иммунного гомеостаза в пределах ЦНС и проницаемости ГЭБ при подостром течении иксодовых клещевых боррелиозов с преимущественным поражением нервной системы, КЭ и микст-формах по семиотике поражения ЦНС;
6) разработать патогенетическую схему клеточно-молекулярных иммунных нарушений при ИКБ (моно и микст-инфекция с КЭ), протекающих с поражением ЦНС;
7) оптимизировать тактику лечения микст-инфекции (КЭ+ИКБ) и собственно КЭ на основе внедрения патогенетически ориентированных методов коррекции нитроксидергических процессов.
Научная новизна
Получена достоверная информация о генетической вариабельности возбудителей ИКБ в основных переносчиках (B. garinii NT 29, B. garinii 20047, В. afzelii) и в биологических материалах от больных (B. garinii, B. afzelii и Borrelia burgdorferi sensu stricto), что подтверждает роль геновидов боррелий патогенного комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato в развитии ИКБ у больных в Челябинской области. Показано спонтанное инфицирование иксодовых клещей вирусом КЭ, относящимся к сибирскому субтипу, субгенотипу «Заусаев». Проведен количественный анализ содержания в клещах ДНК боррелий и РНК ВКЭ посредством ПЦР с электрофоретической или гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов реакций в реальном времени.
Разработан новый подход к изучению центральных механизмов регуляции иммунного ответа на системном и локальном уровнях при клещевых нейроинфекциях, протекающих с поражением ЦНС на основе анализа клеточных (иммунотипирование мононуклеаров ликвора) и гуморальных про- и противовоспалительных факторов (метаболиты нитроксид-молекулы, цитокины, белки системы комплемента, иммуноглобулины, ферритин).
Новыми являются сведения об иммунологических особенностях патогенеза иксодовых клещевых боррелиозов (моно- и микст-инфекция с КЭ), в том числе нарушений проницаемости ГЭБ при микст-инфекции (ИКБ+КЭ), что является основанием для определения направлений коррекции выявленных нарушений. Разработана клеточно-молекулярная схема патогенеза ИКБ и микст-инфекции, протекающих с поражением ЦНС.
Практическая значимость работы
Разработана система повышения качества лабораторной диагностики трансмиссивных клещевых инфекций на эндемичной территории Челябинской области за счет использования современных молекулярно-генетических тестов и расширения спектра определяемых патогенов. Для улучшения лабораторной диагностики внедрены в практическую работу ФГУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии в Челябинской области" современные молекулярно-генетические методы исследования основных переносчиков КЭ, ИКБ, ГАЧ, МЭЧ, что будет способствовать повышению качества экстренной профилактики клещевых инфекций и, в конечном итоге, реальному снижению заболеваемости трансмиссивными клещевыми инфекциями в регионе.
Структуры нуклеотидных последовательностей фрагмента гена белка оболочки ВКЭ (ген Е) депонированы в международный компьютерный банк данных GenBank: 1) TBEV Cheliabinsk GU 143821, 2) TBEV Cheliabinsk GU 143822, 3) TBEV Cheliabinsk GU 143820 под № 1281338, № 1281349, № 1281351.
Оригинальным направлением в лечении изучаемых инфекций является применение патогенетической коррекции нарушений нитроксидергической регуляции при моно- и микст-инфекциях. Новизна способа защищена патентом на изобретение. (№ 2007103435/14(003704): «Применение цитофлавина для лечения клещевых нейроинфекций»).
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Территория Челябинской области является эндемичной по иксодовым клещевым инфекциям (иксодовые клещевые боррелиозы, клещевой энцефалит, микст-инфекция); уровни заболеваемости в течение последних 12 лет превышали показатели по РФ в 2-8 и 5-14 раз соответственно; начиная с 1999 г. в области отмечается тенденция снижения заболеваемости.
2. Молекулярная эпидемиология возбудителей «клещевых» инфекций на территории Челябинской области характеризуется гомогенностью генетической структуры циркулирующего вируса КЭ, изоляты которого принадлежат сибирскому субтипу, субгенотипу «Заусаев» и несоответствием между спектром геновидов боррелий у основных переносчиков (B. garinii NT 29, B. garinii 20047, В. аfzelii) и в биологическом материале от больных (B. afzelii , B. garinii B. burgdorferi s.s).
3. Челябинская область характеризуется своеобразием эпидемиологии клинических форм и явления патоморфоза клещевого энцефалита по сравнению с другими эндемичными регионами РФ, что выражается в утяжелении клинического течения КЭ, росте менингеальных и очаговых форм. Преимущественная циркуляция геновида В. garinii находится в полном соответствии с клинической картиной заболевания и доказанной нами нейротропностью данного геновида борелий (частота поражений нервной системы, в том числе центрального отдела, составляет по нашим данным - 38,3 %, что существенно превышает данные ряда авторов по Пермскому краю (28 %), Иркутской области (27%), Северо-Западному региону России (37,6%). Южный Урал является самой восточной точкой Евразии, где был обнаружен геновид B. burgdorferi s.s.
4. Клещевые нейроинфекции (ИКБ, КЭ и их сочетанные формы) приводят к формированию иммунного ответа на системном и локальном уровнях. Основными патогенетическими механизмами являются: 1) L-аргинин-зависимый механизм с гиперпродукцией метаболитов нитроксид-молекулы в крови и ликворе, 2) прогрессирующий апоптоз как результат прямого проапоптогенного действия NO на клетки-мишени и опосредованного действия нейропатогенов через активацию TNF-, рецептора CD95, 3) воспалительная цитокиновая реакция, 4) оксидативный стресс мембран нейронов и глии.
5. Данные параллельного исследования в сыворотке крови и ликворе флогогенных и антифлогогенных гуморальных факторов отражают характер, выраженность и направленность патологического процесса на различных этапах течения клещевых нейроинфекций (острый период, период реконвалесценции) и позволяют контролировать эффективность комплексной, в том числе, и патогенетически ориентированной терапии. Использование цитофлавина, как средства нейромедиаторной поддержки, с целью коррекции гиперпродукции оксида азота у больных клещевыми нейроинфекциями, является патогенетически обоснованным.
Внедрения
Основные положения и результаты исследования используются в повседневной практической работе инфекционных отделений, ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Челябинской области». В результате проведенного исследования разработаны и внедрены в практику работы отделений инфекционного корпуса № 1, № 4 ГКБ № 8, городского центра нейроинфекций г. Челябинска способ патогенетически ориентированной терапии клещевых нейроинфекций, подтвержденный патентом на изобретение РФ, и способ этиологической диагностики иксодовых клещевых боррелиозов методом ПЦР.
Для осуществления практической деятельности с учетом результатов исследования разработаны и опубликованы методические рекомендации для врачей «Иксодовые клещевые боррелиозы: моно и микст-инфекция (клиника, диагностика, лечение, профилактика)», утвержденые приказом МЗ Челябинской области № 637 от 16.07.2008 г., подготовлен и находится на утверждении в МЗ РФ «Стандарт специализированной медицинской помощи больным иксодовыми клещевыми боррелиозами» (2008 г.)
Материалы диссертации используются в учебном процессе на кафедре инфекционных болезней с курсом эпидемиологии ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия».
Апробация материалов диссертации
Основные положения и результаты работы были представлены на втором Всемирном конгрессе по иммунопатологии и аллергии (Москва, 2004 г.), Всероссийском конгрессе по иммунологии и аллергологии (Уфа, 2005 г.), научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Новосибирск, 2005); Юбилейной научно-практической конференции, посвященной 110-летию кафедры инфекционных болезней военно-медицинской академии им. С.Н.Кирова (СПб., 2006 г.), областных научно-практических конференциях врачей-инфекционистов и эпидемиологов (Челябинск, 2006, 2008), Юбилейной научно-практической конференции «Актуальные вопросы инфекционной патологии в клинической практике», посвященной 70-летию кафедры инфекционных болезней (Уфа, 2007 г.), 7-ом Всероссийском съезде инфекционистов «Новые технологии в диагностике и лечении инфекционных болезней» (Н. Новгород, 2006), научно-практической конференции «Инфекционные болезни: проблемы здравоохранения и военной медицины» (СПб., 2007), на юбилейной научно-практической конференции с международным участием, посвященной 175-летию со дня рождения С.П.Боткина (Санкт-Петербург., 2007), научно-практической конференции, посвященной 75-летию Дагестанской государственной медицинской академии «Инфекционные болезни: актуальные вопросы в клинике и эксперименте» (Махачкала, 2007), межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы внутренних болезней: традиционные и психосоматические подходы» (Челябинск, 2007), научно-практической конференции «Инфекции в практике клинициста: антибактериальная и антивирусная терапия на догоспитальном и госпитальном этапах» (Харьков, 2008 г.), 1 Ежегодном Российском конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2009), Российской научно-практической конференции, посвященной 85-летию кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии Сибирского государственного медицинского университета «Актуальные проблемы инфекционной патологии» (Томск, 2009 г.), межрегиональной научно-практической конференции «Полипатии в семейной и клинической медицине, посвященной 65-летию ЧелГМА и памяти профессора П.Д. Синицина (Челябинск, 2009), 7 итоговой научно-практической конференции молодых ученых Челябинской государственной медицинской академии (Челябинск, 2009), Второй Национальной конференции с международным участием «Нейроинфекции. Современные аспекты клещевых нейроинфекций» (Екатеринбург, 2010), научной конференции с международным участием «Этиологические, эпидемиологические и клинические аспекты инфекционных болезней» (Иркутск, 2010), Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2010. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2010).
По материалам диссертации опубликовано 37 печатных работ, из них 13 в рекомендуемых ВАК изданиях. Имеется патент на изобретение (№ 2007103435/14(003704): «Применение цитофлавина для лечения клещевых нейроинфекций»), методические рекомендации для врачей.
Структура и объем диссертационной работы
Диссертационная работа изложена на 359 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной описанию материалов и методов, восьми глав собственных исследований, обсуждения результатов работы и заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы. Работа иллюстрирована 39 рисунками и 59 таблицами. В работе представлено 8 выписок из истории болезни. Библиографический указатель содержит 478 источников, из которых 230 работ отечественных и 247 зарубежных авторов.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Объекты, методы и объем исследований
Для анализа эпидемиологической ситуации по трансмиссивным клещевым инфекциям в г. Челябинске и Челябинской области изучены архивные данные заболеваемости ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Челябинской области» за период с 1998 по 2010 гг. Источники информации: данные государственной статистической отчетности: Ф. №2 «Сведения об инфекционных и паразитарных заболеваниях», Ф. №5 «Сведения о профилактических прививках, Ф. №60 «Журнал учета инфекционных больных», Ф. №003/У «Медицинская карта стационарного больного», Ф. №025/У «Медицинская карта амбулаторного больного», первичная отчетно-учетная документация лечебно-профилактических учреждений, Центра гигиены и эпидемиологии в Челябинской области (ЧО), Управления Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по ЧО.
В ходе работы по определению антигена ВКЭ исследованы 10411 экземпляров клещей. Определение зараженности возбудителями ИКБ осуществлено у 3185 переносчиков методом темнопольной микроскопии. Генетическая вариабельность боррелий изучена при исследовании 1522 экземпляров клещей Ix. persulcatus, 80 образцов крови больных ИКБ, 30 проб мочи и 10 проб СМЖ. На наличие ДНК E. muris и A. phagocytophilia исследовано 453 клеща. Общее количество проведенных лабораторных исследований приведено в табл. 1.
Для достижения цели и решения поставленных задач был использован комплекс эпидемиологических, серологических, вирусологических, молекулярно-генетических и статистических методов. При анализе эпидемиологической ситуации в отношении трансмиссивных клещевых инфекций в ЧО и г. Челябинске использовали методы описательной и аналитической эпидемиологии (Черкасский Б.Л., 2001). Изучали уровни, возрастную и профессиональную структуру, территориальную приуроченность, сезонность, обстоятельства заражения лиц заболевших КЭ, ИКБ. При проведении ретроспективного анализа заболеваемости основное внимание уделяли ее многолетней и внутригодовой динамике, изучали объем и качество профилактических мероприятий, осуществляемых на территории рекреационных зон г. Челябинска и ЧО. Особое внимание обращали на сведения о наличии профилактической вакцинации против КЭ, объем, полноту и качество проведенных экстренных профилактических мероприятий в отношении возбудителей КЭ и ИКБ. Для обнаружения боррелий в клещах применяли метод темнопольной микроскопии фиксированных препаратов содержимого кишечника клеща (Коренберг Э.И., 1991). Полученные препараты окрашивали по Романовскому-Гимза и докрашивали кристаллическим фиолетовым. Просмотр мазков осуществляли посредством иммерсионной микроскопии с использованием микроскопа МИКМЕД-2.
Таблица 1 Объем проведенных лабораторных исследований
Вид и метод исследования | Количество Исследований |
Определение антигена вируса КЭ в клеще (ИФА) | 10 411 |
Определение зараженности клещей боррелиями (микроскопия) | 3185 |
Определение наличия ДНК боррелий в клеще (ПЦР) | 1522 |
Определение наличия ДНК боррелий в крови (ПЦР) | 80 |
Определение наличия ДНК боррелий в моче (ПЦР) | 30 |
Определение наличия ДНК боррелий в ликворе (ПЦР) | 10 |
Определение наличия ДНК эрлихий и анаплазм в клеще (ПЦР) | 453 |
Определение наличия ДНК эрлихий и анаплазм в крови (ПЦР) | 453 |
Определения наличия РНК вируса КЭ в клеще (ПЦР) | 180 |
Всего | 16324 |
Для детекции специфического фрагмента ДНК боррелий в клещах использовали метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) с набором реагентов для амплификации фрагмента 16SpРНК Borrelia burgdorferi sensu lato (Borrelia burgdorferi sensu stricto B. garinii, B.afzelii) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации с тест-системой «AmplisensBorrelia burgdorferi sensu lato-Eph» согласно инструкции производителя.
Для количественной оценки заражённости таёжных клещей ВКЭ и боррелиями исследовали 169 особей Ixodes persulcatus Schulze. Голодных имаго таёжного клеща собирали в мае 2009 г. с растительности в Каштакском бору вблизи поселка Каштак Челябинской области и в Еткульском районе Челябинской области (5509' с.ш., 61026' в.д.). Видовую принадлежность клещей определяли по морфологическим признакам (Павловский А.Е., 1959).
Для обнаружения вируса КЭ в клещах применяли комплекс методов. ИФА клещевых суспензий выполняли с применением тест-системы «ВектоВКЭ-антиген-стрип» и «ВекторВКЭ-антиген» (ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск, серия № D1154). Результаты ИФА учитывали на спектрофотометре ELx800 (BIO-TEK Instruments, USA) при длине волны 450 нм. Детекцию РНК вируса КЭ в клещах осуществляли с помощью коммерческой ПЦР-тест-системы «ВектоВКЭ-РНК-ампли-100» согласно инструкции производителя («Вектор-Бест», Новосибирская область).
Выделение штаммов ВКЭ проводили на культуре клеток СПЭВ. Клетки почки эмбриона свиньи (СПЭВ) в среде МЕМ с 10 % эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС) выращивали до полного монослоя и проводили заражение клещевыми суспензиями, положительными в ИФА, в минимальном объеме среды МЕМ без сыворотки 1 ч при 37 0С. Наблюдение за развитием цитопатического эффекта проводили в течение последующих 3-5 дней.
Нуклеиновые кислоты из индивидуальных клещевых суспензий выделяли с использованием набора РИБО-сорб производства «ИнтерЛабСервис» (г. Москва) в соответствии с инструкцией производителя.
Детекцию ДНК боррелий проводили посредством ПЦР с тест-системой «Ампли-Лайм» (# КА-002-2) производства ООО "Омникс" (г. Санкт-Петербург) в следующем режиме: 940С, 1 мин., 520С, 1 мин., 720С, 1 мин., 7 циклов, 940С, 1 мин., 560С, 1 мин., 720С, 1 мин., 23 циклов, 720С 10 мин. на амплификаторе «Терцик» производства «ДНК-технология» (г. Москва). Электрофорез продуктов ПЦР проводили в 2% агарозном геле в ТБЕ (Maniatis et al., 1982).
ПЦР в реальном времени проводили с использованием RotorGene 6000 (Corbett Research, Австралия) в следующем режиме 940С 10 сек., 600С 60 сек. 50 циклов. Для количественных оценок ДНК боррелий использовали праймеры и зонд, соответствующие гену основного белка жгутика flaB боррелий комплекса B.burgdorferi s.l. в соответствии с (Hodzic E. et al., 2003). Для построения калибровочной прямой использовали ДНК B. burgdorferi sensu stricto штамм B31 из чистой бактериальной культуры, предоставленную проф. F.Cabello (Medical College.Valhalia. New York, CША) с известной оптической плотностью при длине волны 260 нм.
Детекцию РНК вируса КЭ в клещах осуществляли с помощью коммерческой ПЦР-тест-системы «ВектоВКЭ-РНК-ампли-100» согласно инструкции производителя («Вектор-Бест», Новосибирская область). Генотипирование штаммов вируса КЭ осуществляли методом ОТ-ПЦР с детекцией продуктов реакций в режиме реального времени с TaqMan зондами, специфичными для разных генетических типов ВКЭ и путем секвенирования по методу Сэнгера с помощью автоматического секвенатора ABI 373 (Applied Biosystems, США). Мишенью для праймеров (TBE-291 TTCCTGGAYTTGAGAGAGAGGAACCAACCAACACA TBE-31,3 CATGAGCAGTTYCTGARGTCAGTGACCA) и зондов (TBE-FE FAM-CATGGCAGTCCACACAGACCAGA-BQH1, TBE-FE-Ch FAM-CFTGGGAGTTCACACAGATCFGA-BQH1 (дальневосточный генотип), TBE-S FAM- CFTGGCGGTCCACFCTGACCAAA-BQH1 (сибирский генотип), TBE-E ROX-AGTGCCTGTGTCATTTTTCATTGAT-BQH2 (европейский генотип) является участок NS1 гена. Филогенетический анализ определённой нуклеотидной последовательности исследуемых штаммов или изолятов и нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК из базы данных GenBank (ссылка скрыта) проводили с использованием программы MEGA версии 4 (Kumar S, Tamura K, Nei M., 2004). Для количественных оценок использовали серию разведений рекомбиниантной плазмиды p BR322-TBEVS*, содержащей клонированную полномеразную ДНК-копию генома ВКЭ ( штамм Софьин).
ДНК эрлихий и анаплазм в образцах клещей выявляли с помощью двухраундовой ПЦР с тест-системой «АмплиСенс».
Общая характеристика обследованных больных, материалов и клинико-лабораторных методов исследования
За период с мая 2002 года по ноябрь 2009 года было обследовано 537 больных с различными клиническими формами инфекций, передающихся иксодовыми клещами. Исследование проводилось методом сплошной выборки среди госпитализируемых больных в остром периоде, в фазе ранней реконвалесценции, а так же после проведения соответствующего этиотропного и патогенетического лечения. Обследование и лечение больных осуществлялось на базе клиники кафедры инфекционных болезней ГОУ ВПО «ЧелГМА», городского центра нейроинфекций, 1-го и 4-го инфекционных отделений ГКБ № 8 г. Челябинска. Среди больных было мужчин 310 (57,7%) и женщин 227 (42,3) в возрасте от 17 до 65 лет. Возраст большинства (84,8%) пациентов не превышал 50 лет. Все пациенты отрицали ранее перенесенные ИКБ и КЭ. Большинство переболевших находились под диспансерным наблюдением в течение 6 месяцев - 1 года. Гендерная характеристика, распределение больных по формам заболевания представлены в табл. 2. Больные ИКБ в соответствии с клинико-патогенетической классификацией (Лобзин Ю.В., 2001) были разделены на 3 группы: острое течение (n= 220), подострое течение (n = 34) , хроническое течение (n= 16). По клиническому маркеру заболевания больные с острым течением инфекционного процесса были разделены нами на две подгруппы: 1 группа – 160 человека (72,7 %) с эритемной формой заболевания и 60 пациентов (27, 3%) с безэритемной формой ИКБ. Легкая степень острых манифестных форм ИКБ наблюдалась у 190 больных, и характеризовалась субфебрильной температурой тела, коротким периодом лихорадки (3-4 дня), умеренно выраженными симптомами общей интоксикации. Мультисистемные симптомы были выражены слабо, либо отсутствовали. К средней степени тяжести относили заболевание (69 человек) с выраженными признаками поражения различных тканей и органов: периферической и центральной нервной системы, сердца, суставов. У этой категории больных температура тела повышалась до 38.0-39.0оС, был ярко выражен синдром общей инфекционной интоксикации. Диагноз хронического ИКБ подтверждали при наличии клинических симптомов, характерных для данного периода развития болезни, и при обязательном обнаружении в сыворотке крови антител к боррелиям в ИФА. У части пациентов подострое и хроническое течение было диагностировано в процессе активного диспансерного наблюдения за реконвалесцентами, перенесшими острый ИКБ.
Все пациенты с хроническим течением ИКБ, с целью уточнения характера и уровня поражения НС, кожи, суставов и сердца, осматривались неврологом и терапевтом. Инфицированность одновременно несколькими патогенными боррелиями, входящими в одну группу спирохет B. burgdorferi s.l., позволило рассматривать данную ситуацию как боррелиозную микст-инфекцию с различными вариантами сочетания обнаруженных геновидов (n= 25).
Таблица 2
Распределение больных по возрасту, полу и формам заболевания (n= 537)
Группы больных | Мужчины | Женщины | ||||
абс. | % | Средний возраст | абс. | % | Средний возраст | |
ИКБ (n=267) эритемная форма (n= 200) безэритемная форма (n=67) | 150 | 48,4 | 41,5 +2,8 | 117 | 51,5 | 43,1+1,3 |
113 | 36,3 | 44,8+1,8 | 84 | 37 | 44,4+2,5 | |
37 | 11,9 | 38,3+1,4 | 30 | 13,2 | 42,1+2,0 | |
МИ (ИКБ+КЭ) (n=100) | 60 | 19,4 | 35,7+2,3 | 40 | 17,6 | 36,61,8 |
КЭ (n= 170) | 100 | 32,3 | 37,5±3,3 | 70 | 30,8 | 38,4±2,1 |
ВСЕГО: | 310 | 100 | 39,5± 3,5 | 227 | 100 | 40,9±3,1 |
С целью изучения иммунного гомеостаза на системном и локальном уровнях обследовали более 300 сывороток крови и более 80 проб СМЖ больных с различными формами изучаемых инфекций. Ликворологические исследования проводили по преимущественным синдромам поражения нервной системы у обследованных контингентов больных (менингит, менингоэнцефалит, менингорадикулоневрит). Общее количество больных с данными синдромами составило 186 человек, из них 47 - больные с боррелиозной (преимущественно подострое течение с развитием серозных менингитов) и микст - инфекцией (КЭ+ИКБ). Исследуемые группы были сопоставимы по возрасту, ведущему клиническому синдрому, этиологии поражения нервной системы. Спектр неврологических синдромов у обследованных лиц представлен в табл.3. У большинства больных ИКБ, КЭ и МИ в периоде реконвалесценции проводилась оценка нервно-психического статуса и изучались когнитивные функции (300 исследований).
Контрольную группу подбирали методом случайной выборки. Ее составили 30 условно-здоровых лиц, сопоставимые по полу и возрасту, не предъявлявшие на момент обследования жалоб и не обнаруживающие отклонений при физикальном исследовании, не имеющие хронических инфекционных и соматических заболеваний, подвергнутые аналогичным по объему исследованиям. Контрольную группу (n=25) для ликворологических исследований составили больные, поступавшие в инфекционное отделение с подозрением на серозный менингит, у которых цитологическое, биохимическое, бактериологическое и молекулярно-биологическое исследование ликвора не выявило отклонений от соответствующих нормальных показателей: цитоз не превышал 5 клеток в 1 мкл ликвора, белок 0,15-0, 45 г/л, глюкоза 2,0-4,18 ммоль/л при одновременном определении аналогичного показателя в сыворотке крови, где он в норме в 2 раза выше, хлориды 120,0-130,0 ммоль/л, имуноглобулин G < 40 г/л (Базарный В.В., 2003). Для отбора контрольной группы использовали современные лабораторные методы иммуноанализа (латекс-аглютинация, ИФА, ПЦР). Ретроспективно учитывались результаты серологической диагностики, в обязательном порядке - ИФА на антитела к вирусу КЭ и боррелиям.
Таблица 3
Семиотика неврологических расстройств у обследуемых контингентов больных
Синдромы | МИ (КЭ+ИКБ) | КЭ | ИКБ | |||
абс. | % | абс. | % | абс. | % | |
Менингеальный | 20 | 20 | 117 | 68,8 | 10 | 3,7(20)* |
Менингорадикулярный | 5 | 5 | 2 | 1,2 | 5 | 1,8(10)* |
Менингоэнцефалитический | 5 | 5 | 20 | 11,8 | 2 | 0,8(4)* |
Полиоэнцефалитический | - | - | 5 | 2,9 | - | - |
Полиомиелитический | 3 | 3 | 15 | 8,8 | - | - |
Алгический | 30 | 30 | 10 | 5,8 | 10 | 5,6(30)* |
Примечание.* Для больных с ИКБ % отдельно приведен для группы с подострым и хроническим течением (n=50), так как неврологические расстройства не характерны для острого течения заболевания.