Дальневосточный федеральный университет дальневосточный институт инновационных технологий и качества академия экологии, морской биологии и биотехнологии
| Вид материала | Документы |
- Дальневосточный федеральный университет, 61.97kb.
- А. Н. Малютин Дальневосточный морской биосферный государственный природный заповедник, 110.71kb.
- Положение о магистратуре федерального государственного автономного образовательного, 418.7kb.
- Правлением ОАО «Дальневосточный банк», 78.08kb.
- Совершенствование управления качеством при формировании интегрированных систем менеджмента, 270.66kb.
- Дальневосточный государственный университет восточный институт, 1418.89kb.
- 1. Общие положения, 275.75kb.
- «Менеджмент систем качества», 50.31kb.
- 14. дальневосточный экономический район, 1428.3kb.
- Программа I краевого съезда учителей и преподавателей математики хабаровского края, 344.82kb.
Министерство образования и науки России
ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫЙ ИНСТИТУТ ИННОВАЦИОННЫХ ТЕХНОЛОГИЙ И КАЧЕСТВА
___________АКАДЕМИЯ ЭКОЛОГИИ, МОРСКОЙ БИОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ____________
УДК 338.2
МАТЕРИАЛЫ
ВСЕРОССИЙСКОЙ НАУЧНОЙ ШКОЛЫ ДЛЯ МОЛОДЕЖИ
«ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ ИННОВАЦИЙ
В БИОЛОГИИ»
Под общей редакцией
Н.В. Воеводиной
Л.С. Бузолевой
Н.Н. Ханчук
СОДЕРЖАНИЕ
ПРЕДИСЛОВИЕ ……………………………………………………………………………5
Раздел I
НАУКА БИОЛОГИЯ КАК ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНЫЙ РЕСУРС……………………..9
Глава 1. Л.С. Бузолева. Влияние экзометаболитов микрофлоры обсеменяющей пищевые продукты, на пролиферативные свойства ассоциированной с ними L. monocytogenes …………………………………………………………………….......9
Глава 2. Т.А. Кузнецова. Бифидосодержащие продукты функционального питания…………………………………………………………………………….....18
Глава 3. Н.Л. Белькова, Е.В. Суханова, Н.Н. Деникина, О.Т. Русинек,
Е.В. Дзюба. Молекулярно-генетические методы в изучении кишечной
микрофлоры лососевидных рыб озера Байкал: проблемы и решения…………...26
Глава 4. А.Г. Гербст. Подходы к компьютерному моделированию углевод-белковых взаимодействий…………………………………………………………..40
Глава 5. С.В. Охотина. Бактериальные биопленки и ремедиация среды……...43
Глава 6. Н.Л. Белькова, Е.Б. Матюгина, С.О. Воронова, Н.В. Долгих. Современные методы идентификации и детекции физиологического статуса водных микроорганизмов…………………………………………………………...46
Глава 7. И.А. Теркина, Г.А. Федорова, О.П. Глызина, В.В. Парфенова.
Поиск и исследование новых антимикробных метаболитов, продуцируемых бактериями озера Байкал……………………………………………………………48
Глава 8. Н.Б.Цветкова. Изменчивость биологических свойств Listeria monocytogenes под действием абиотических факторов при культивировании на пищевых продуктах…………………………………………………………………57
Глава 9. И. А. Теркина. Актиномицеты озера Байкал, как перспективные источники биологически-активных соединений……………………………….....60
Глава 10. Л.С. Бузолева. Влияние холодового обогащения на синтез
биологически активных веществ у возбудителей сапрозоонозов………………..61
Глава 11. А.В. Гринченко, В.В. Кумейко. Активность агглютинирующих
факторов гуморальногоиммунитета двустворчатых моллюсков Modiolus
kurilensis и Anadara broughtoni из некоторых акваторий Японского моря……...62
Глава 12. Ю.Н. Сокольникова, В.В. Кумейко. Показатели фагоцитоза
гемоцитов двустворчатых моллюсков Modiolus kurilensis из некоторых
акваторий Японского моря с незначительной антропогенной нагрузкой…….....65
Глава 13. А.А. Анисимова. Использование метода проточной цитофотометрии для оценки пролиферативной активности гемоцитов и диагностики гемоцитарной неоплазии у двустворчатых моллюсков…………………………..67
Глава 14. А.В. Мартынова, А.П. Прушинский, Е.С. Носач, О.А. Чулакова. Разработка метода идентификации и генотипирования микроорганизмов-возбудителей инфекций респираторного тракта…………………………………..70
Раздел II
БИОТЕХНОЛОГИИ КАК ПРОИЗВОДСТВЕННЫЙ РЕСУРС ………….................73
Глава 1. Е.А. Бородин. Инновационные технологии в производстве пищевых продуктов из сои. Использование соевых продуктов в медицине…………….....73
Глава 2. М.В. Антонюк, Б.И. Челнокова, Т.А. Гвозденко, О.Н. Фотина. Лечебные грязи Приморского края и перспективы их использования…………..83
Глава 3. Н.Е. Спиченкова. Морская экспериментальная станция ТИБОХ ДВО РАН (МЭС) – база для образовательных, научных и прикладных программ.......93
Глава 4. Е.А. Богатыренко. Пробиотики как перспективное направление в биотехнологии……………………………………………………………………….94
Глава 5. А.А. Коротких, И.Э. Памирский, М.А. Штарберг, Е.А. Бородин. Создание фармацевтического препарата на основе соевого ингибитора трипсина…………………………………………………………………………......99
Глава 6. М.Л. Сидоренко. Оценка возможности использования лиственничной губки в качестве источника биологически активных веществ……………….....103
Глава 7. Е.А. Остапенко. Характеристика микрофлоры обрастания причальных сооружений бухты Парис………………………………………………………….106
Раздел III
УПРАВЛЕНИЕ ПРОДВИЖЕНИЕМ БИОТЕХНОЛОГИЙ ………………………..109
Глава 1. Н.В.Воеводина. Инновации: от науки к интеллектуальному ресурсу……………………………………………………………………………...109
Глава 2. Н.Н. Ханчук. Некоторые вопросы сущностных категорий в теории инноваций………………………………………………………………………… 111
Глава 3. Т.А. Жукова. Эффективная презентация как инструмент управления инновациями………………………………………………………………………..122
Глава 4. И.В. Глущук. Управление инновационным проектом на примере продвижения разработки «Пробиотики»…………………………………………125
Глава 5. П.Ю. Долгих. Внедрение результатов научного исследования……...129
Глава 6. Т.Е. Лопатина. Синергический эффект развития инновационного предпринимательства в сфере высоких технологий……………………………..131
Раздел IV
РАЗВИТИЕ НАУКОЕМКОГО ПРОИЗВОДСТВА ………………………………......135
Глава 1. А.П. Мирошниченко. Интересы бизнеса в инновационной
деятельности………………………………………………………………………..135
Глава 2. В.Д. Даровских. Мобильный микроманипулятор (наноробот) для
сервиса биологических и технических систем…………………………………...137
НАШИ АВТОРЫ……………………………………………………………….................150
ПРЕДИСЛОВИЕ
Инновационная деятельность характерна развитием системных связей между наукой, образованием, хозяйствующими субъектами, государственными мероприятиями и финансовыми учреждениями. Развитие системных связей является сегодня процессом крайне нестабильным, реагирующим на множество факторов риска. Системность связей формируется этапами и рассматривается как экономические отношения. Таким образом, инновация выражает экономические отношения, возникающие по поводу трансформации знания в фактор производства. Функции инновации:
- Междисциплинарная организация проектирования.
- Систематизация научного знания и научного опыта.
- Создание интеллектуального ресурса.
Регулирование инноваций в РФ реализуется Стратегией инновационного развития, Политикой инновационного развития, Федеральными целевыми программами и финансовой политикой РФ. Инновации являются частью бюджетной системы РФ, так как инновационная деятельность и развитие инновационной инфраструктуры финансируется из федерального и местного бюджетов. Инновации также являются частью финансовой системы, так как НИОКР координируется Межведомственной комиссией по научно-инновационной политике. Эффективность НИОКР в вузах или на предприятии вливается в процесс денежно-кредитного регулирования.
Цель Стратегии инновационного развития РФ сформулирована следующим образом: конкурентоспособность технологичной продукции и восприимчивость инноваций бизнесом. Ожидаемые результаты сформулированы как:
- внебюджетное финансирование инновационной деятельности довести до 70%;
- рост числа технологичных малых предприятий. При этом показатели инновационного развития запланированы в следующем содержании и интервалах значений.
Таблица 1 - Целевые показатели Стратегии
| | 2004 | 2007 | 2010 | 2015 |
| 1. Коэффициент изобретательской активности (число патентных заявок на изобретения, поданных российскими заявителями в стране, в расчете на 10 тыс. населения) | | | | |
| инерционная динамика | 1,6 | 1,9 | 1,94 | 1,99 |
| с учетом реализации Стратегии | 1,6 | 2,0 | 4,0 | 5,5 |
| 2. Число зарегистрированных договоров об уступке патента и лицензионных договоров (тыс. ед.) | | | | |
| инерционная динамика | 2,0 | 2,3 | 2,6 | 3,1 |
| с учетом реализации Стратегии | 2,0 | 2,9 | 4,6 | 8,1 |
| 3. Удельный вес нематериальных активов в общей сумме активов организаций сектора исследований и разработок (%) | | | | |
| инерционная динамика | 0,7 | 1,5 | 3,5 | 8,5 |
| с учетом реализации Стратегии | 0,7 | 7,0 | 15,0 | 30,0 |
Для достижения поставленных ориентиров выбраны такие инструменты регулирования инновационной деятельности, как:
- Развитие производственно-технологической инфраструктуры (технопарки, инновационно-технологические центры, бизнес-инкубаторы, центры трансфера технологий, инжиниринговые центры и т.п.);
- Содействие развитию связей в рамках инновационной деятельности и «диффузии» знаний, поддержка совместных исследований на стадии экспериментальных исследований и опытных производств.
Сдерживание инновационной активности возникает по двум причинам:
- Недофинансирование процессов по причине размытости критических направлений, информационной непрозрачности результатов научно-технической деятельности, отсутствия технологической и индустриальной оценки, неэффективного использования средств местных бюджетов;
- Высокая стоимость нововведений: отсутствие института государственных гарантий, отсутствие связей между вузом и предприятиями «прикладные исследования – опытно-конструкторские разработки – производство».
Стратегия инновационного развития экономики РФ послужила фундаментом для формулировки политики инновационного развития РФ, цель которой - формирование экономических условий для вывода на рынок конкурентоспособной инновационной продукции в интересах реализации стратегических национальных приоритетов Российской Федерации.
При этом Политика провозглашает следующие механизмы ее реализации - установление порядка закрепления и передачи прав на результаты интеллектуальной деятельности гражданского и двойного назначения, созданные за счет средств федерального бюджета, с целью их введения в хозяйственный оборот. Механизм реализации направлен на содействие развитию торговли ценными бумагами предприятий высокотехнологичных отраслей.
Политика инновационного развития реализуется через Федеральную Целевую Программу «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России», которая выполняется в рамках следующих приоритетных тематических направлений:
- информационно-телекоммуникационные системы;
- индустрия наносистем;
- стратегические и перспективные материалы;
- технологии живых систем;
- рациональное природопользование;
- энергетика и энергосбережение;
- безопасность и противодействие терроризму.
Второй этап ФЦП (2010-2012гг.) ставит задачи:
- технологической модернизации экономики и повышение ее конкурентоспособности;
- обеспечения активного развития инновационной деятельности предприятий.
Развитие инноваций как части финансовой системы должно учитывать тенденции развития финансового рынка РФ. Основные направления единой государственной денежно-кредитной политики ЦБ РФ на 2010г. и период 2011 и 2012гг. ставит следующие ориентиры развития:
- ставка рефинансирования – 10%;
- снижение инфляции до 9-10% в 2010г. и 5-7% в 2012г.;
- переход к плавающему валютному курсу.
Таким образом, перспективы развития инноваций в биологии базируется на следующих инструментах государственного регулирования инноваций:
1. Усиление контроля за эффективностью НИР - оптимизация затрат на первичную экспертизу экономической содержательности НИР;
2. Кредитование технико-внедренческой деятельности малых предприятий – будет консервативным;
3. Совместное сосуществование инвестора, хозяйства и ученого – по принципу минимизации затрат;
4. Основной источник финансирования НИОКР – бюджетные средства;
5. Развитие инвестиций в инновации - зависит от уровня подготовки кадров.
Из этого следует, что основными функциями инновацтй должны быть:
1.Подготовка специалистов;
2. Управление стоимостью внедрения;
3. Управление трудоемкостью работ;
4. Управление финансами инновационных хозяйств;
5. Управление естествознанием.
Н.В.Воеводина
___________________________________________________________________________
Раздел I
НАУКА БИОЛОГИЯ
КАК ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНЫЙ РЕСУРС
___________________________________________________________________________
Л.С. Бузолева
Глава 1. ВЛИЯНИЕ ЭКЗОМЕТАБОЛИТОВ МИКРОФЛОРЫ, ОБСЕМЕНЯЮЩЕЙ ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ, НА ПРОЛИФЕРАТИВНЫЕ СВОЙСТВА АССОЦИИРОВАННОЙ С НИМИ L. MONOCYTOGENES.
Введение
Данные зарубежных и отечественных исследований за последние годы свидетельствуют об исключительно широких адаптивных способностях листерий, позволяющих им размножаться в сапрофитической фазе в различных природных субстратах (растительных, почвенных, водных). Листерии способны к размножению в широком диапазоне температуры, влажности и рН среды, а их высокая метаболическая пластичность обусловливает возможность перехода от сапрофитической фазы к паразитической и наоборот, что, наряду с традиционными представлениями о связи листерий с теплокровными организмами, позволяет рассматривать листерии как типичный сапрозооноз.
Особенности экологии листерий проявляются и при контаминации ими продуктов питания животного и растительного происхождения.
Если в работах 10-20 летней давности листериозную инфекцию прежде всего связывали с употреблением в пищу сырых продуктов животного происхождения или непосредственным контактом с животными, особенно с грызунами, то в последние годы многочисленные эпидемические вспышки листериоза в высокоразвитых странах мира (США, Великобритания, Канада, Франция) были связаны с употреблением готовых продуктов пищевой индустрии, прошедших соответствующую обработку и контроль (сыры, особенно мягкие, различные мясные полуфабрикаты для приготовления «fast food», салаты и др.). Причем в США листериоз по числу смертельных исходов лидирует среди других пищевых инфекций (до 30%). У чувствительных людей листериоз могут вызвать всего 100 клеток L. monocytogenes, поэтому даже непродолжительный период хранения пищевого продукта с листериями при температуре бытового холодильника в течение 1,5-3 дней может сделать продукт опасным для здоровья.
Таким образом, в настоящее время листериоз следует рассматривать, прежде всего, как пищевую инфекцию с четко обусловленным путем преимущественного распространения, что диктует необходимость разработки системы индикации листерий в продуктах питания (Douglas A., 1992).
На сегодняшний день экология и эпидемиология листериоза еще полностью не раскрыта. До сих пор остается неясным, что влияет на вирулентные свойства и размножение L. monocytogenes при культивировании на продуктах питания.
- Экономический ущерб
По данным профессора H. Seeliger (1989) листерии выявлены в 30 различных видах продукции Европейского происхождения. В настоящее время проблема пищевого листериоза помимо медицинского, приобретает и существенное социально-экономическое значение. Изъятие зараженных продуктов из торговли, ограничение ввоза и вывоза, остановка производства приносят ущерб в сотни миллионов долларов США и европейским странам – экспортеров сыра и мясных продуктов (Carvajal A., Fredericsen W., 1988; Карликанова Н., 1999; Костенко Ю., 1997).
Так, в марте 1999 года в порционных упаковках сливочного масла от 5 до 10 граммов финской компании «Милка» были обнаружены патогенные листерии. Из 18 заболевших трое скончались. Завод был закрыт, проведено тщательное расследование. Листериями было заражено оборудование. А спустя некоторое время листерии обнаружились во Франции, в сырах, произведенным небольшим фермерским заводом, в сортах «Эпуаз» и Сумэтрен» (www.mega.kemerovo.su).
Во Франции в 2000 году компании Nestle пришлось изъять из продажи 114 тысяч коробок с мороженым, зараженных листериями (Агенство News, 2000г.).
Около 30 млн. фунтов мяса, а так же мясных полуфабрикатов пришлось изъять из розничной продажи американской компании Wample Foods после того, как анализы выявили их заражение патогенными листериями. Это крупнейшее изъятие мяса кур и индеек за всю историю Минсельхоза США (до сих пор самым крупным оставался отзыв из розничной торговли около 11 тонн фарша для гамбургеров, проведенный в 1997 году). Все продукты из мяса домашней птицы были уничтожены (Агенство ФгроФакт, 2002г.).
В апреле 2005 года в Алтайский край была завезена очередная партия (101 тонна мяса птицы) окорочков цыплят в декоративной обсыпке гриль. Краевой ветеринарной инспекцией в образцах мяса были обнаружены листерии (Агенство АМИТЕЛ, 2005г.). В Российскую Федерацию был поставлен мягкий сыр «Fermier Calvet feuille x 12» (Cavet Picodons Sarl, Франция), произведенный из сырого молока, инфицированный листериями.
Канадская инспекция пищевых продуктов отозвала из продажи несколько видов сэндвичей и ростбифов, зараженных листериями, которые продавались в Онтарио. Жителям советовали не употреблять в пищу готовые ростбифы и сэндвичи торговой марки «Mainline Market Best Picks». Также были отозваны сэндвичи и ростбифы из магазинов в Ривервью (Нью-Брансуик), Сиднее и Дартмаусе, что в Новой Шотландии. В пятницу инспекция отозвала 10 видов сэндвичей, проданных компанией «William Davids Foods Ltd» в Онтарио. Ростбифы, отозванные из продажи, произведены квебекской компанией «Les Salaisons Desco Inc.», располагающейся северо-восточнее Монреаля. Ранее продукция этой компании отзывалась уже дважды. 21 октября в Квебеке были отозваны сэндвичи под торговой маркой «Plaisirs Gastronomiques», а 23 октября – сэндвичи «Savco», проданные в Сарнии, Онтарио. Недавние вспышки листериоза в Торонто и Квебеке (Канада, 2009г.) подтвердили причастность к ним именно сыров и мясных продуктов питания. Число жертв заражения пищевыми продуктами с листериями в Канаде достигло 19 человек. Источник заражения - мясоперерабатывающий завод компании "Мейпл лиф" в окрестностях Торонто. Следы опасной бактерии были обнаружены на двух разделочных машинах. Завод с 20 августа был закрыт на глубокую санитарную обработку, а из торговли были отозваны продукты около 200 наименований на общую сумму около 20 млн. долларов. Еще одна вспышка листериоза зарегистрирована в Квебеке: там источником бактериального заражения стали сыры и по решению органа санитарного контроля провинции 11 видов продукции местной сыроваренной промышленности были изъяты из продажи.
В 2008 году Россельхознадзор ввел временные ограничения на поставки продукции с ряда европейских и одного азиатского предприятия. Как сообщили ИТАР-ТАСС в этом ведомстве, при мониторинге на безопасность поступающей в Россию пищевой продукции было обнаружено около 60 тонн опасных для здоровья человека товаров. Так, задержана 1 тонна французского куриного мяса и 32 тонны исландской икры мойвы, в которых были обнаружены листерии. Это послужило поводом к введению временных ограничений на ввоз в РФ продукции с предприятий-поставщиков.
В конце прошлого года - начале этого поступила партия мясопродуктов (сосиски и готовый продукт "Мясо для завтрака") в количестве 40 тонн из штата Арканзас. Мясопродукты были распределены в торговой сети Москвы, Санкт-Петербурга и Мурманска. Обнаружив в продуктах бактерии листерии, Департамент ветеринарии Министерства сельского хозяйства и продовольствия России уведомил об этом Минсельхоз США, изъял продукты из продажи и через посольство США решает вопрос о возвращении опасных продуктов изготовителю.
Таблица 2 – Случаи заболеваемости пищевым листериозом (на основании данных литературы за последние 10 лет)
| Страна | Продукт | Причина заражения | Случаи заболеваний |
| США | Фарш для гамбургеров, 1999 год | Контаминация оборудования | Нет |
| Сыр, 2002 год | Добавление сырого молока | 142 заболевания, 47 летальных исходов | |
| Горячие сосиски (hot dog), 2002год | Контаминация оборудования | 79 заболеваний, 20 летальных исходов | |
| Мясо кур, 2002 год | Контаминированное сырье | 120 заболеваний, 20 летальных исходов | |
| Свиные и говяжьи сосиски, 2006 год | Контаминация на производстве | Нет | |
| Молоко из супермаркета, 2008 год | Контаминация оборудования | 6 заболеваний, 3 летальных исхода | |
| Швейцария | Сыр 2007 год | Контаминация на производстве | 122 заболевания |
| Англия | Паштет, 2006 год | Контаминация на производстве | Свыше 300 заболеваний |
| Сэндвичи, 2007 год | Контаминация на производстве | Нет | |
| Франция | Языковая колбаса, 1997 год | Контаминация оборудования | 279 заболеваний, 63 летальных исхода |
| Сыр, 1999 год | Контаминация оборудования | Нет | |
| Шотландский атлантический копченый лосось, 2000 год | Контаминация на производстве | Нет | |
| Мороженое, 2000 год | Контаминированное молоко | 10 заболеваний | |
| Студень из языка, 2000 год | Контаминация оборудования | 24 заболевания, 7 летальных исходов | |
| Италия | Колбаса, 2001 год | Контаминация в хранилище | 1300 заболеваний |
| Финляндия | Сливочное масло, 1999 год | Контаминация оборудования | 18 заболеваний, 3 летальных исхода |
| Канада | Мясные продукты, 2008 год | Контаминация оборудования | 26 заболеваний, 12 летальных исходов |
| Сыр, 2008 год | Контаминация на производстве | 18 заболеваний, 1 летальный исход | |
| Бразилия | Говядина, 2007 год | Котаминированное сырье | Нет |
| Эстония | Филе сельди в растительном масле, 2006 год | Контаминация на производстве | Нет |
| Россия | Окорочка цыплят, 2004 год | Контаминация на складах | Нет |
| Камбала дальневосточная, 2005 год | Контаминация на складах | Нет |
- Меры контроля на производстве
Происшедшие вспышки листериоза показали, что в самой технологии приготовления ряда продуктов содержится опасность контаминации листериями и их размножения до высоких концентраций. Возбудитель листериоза L. monocytogenes попадает на предприятия с сырьем, пищевыми ингредиентами (чаще растительного происхождения), с необеззараженной водой, с частицами почвы, уличной пыли, с упаковочным материалом. Источником листерий могут быть работники предприятия, занятые на начальных этапах переработки сырья, плохо вымытые и необеззараженные руки персонала, контактирующего с сырьем, полуфабрикатом или готовой продукцией.
Местами размножения листерий могут быть любые недостаточно очищенные и продезинфицированные технологические поверхности, которые имеют выемки, полости, трещины, царапины и которые постоянно или регулярно увлажняются во время работы. Листерии сохраняют жизнеспособность на холодных поверхностях оборудования и способны на них размножаться. На поверхности технологического оборудования, в микротрещинах и царапинах, листерии образуют микроколонии, покрытые дополнительной оболочкой, так называемые «биопленки», которые не удаляются обычными моющими средствами.
Частично проблема поступления патогенных листерий на производство может быть решена введением в практику процедуры санации сырья и вспомогательных материалов. Тем не менее эта процедура не исключает попадания листерий на предприятие другими путями. То есть вероятность попадания листерий на любое производство постоянно остается высокой, а пути распространения листерий не всегда легко выявляются. Для гарантированного снижения численности L. monocytogenes в готовой продукции ниже норматива следует создать систему защиты предприятия от патогенных листерий и наладить постоянный мониторинг их распределения.
Контроль за распространением листерий не будет успешным, если на производстве нарушаются правила GMP («Правильной производственной деятельности») или не соблюдаются санитарные требования по организации технологического процесса (СанПин 2.3.4.050-96). На начальном этапе создания контроля за листериями следует заново оценить, насколько целесообразно распределены стадии технологического процесса по помещениям, нет ли резерва в организации производства для снижения вероятности как вторичного заражения листериями сырья, полуфабрикатов, готовой продукции, так и их размножения, образования на оборудовании зон постоянной локализации.
Для организации и проведения контроля за распространением L. monocytogenes назначается ответственное лицо, которое разрабатывает план контрольных мероприятий и, что особенно важно, постоянно корректирует его в зависимости от результатов проверки эффективности процедур мойки и дезинфекции. (Дмитириева, Мухина, 2008).
При проведении бактериологического контроля продуктов питания на наличие листериозной инфекции необходимы: быстрота исследования, так как пищевые продукты не могут долго храниться, высокая достоверность результатов, не только качественный, но и количественный анализ, т. е., определение величины контаминации (Бакулов, Васильев, 1999). Для достижения этих целей необходимо совершенствовать лабораторную диагностику листериоза в том числе методы экспресс-контроля листерий в продуктах питания и других потенциально опасных для человека объектах.
На сегодняшний день бактериологический метод является основным для обнаружения и идентификации листерий. Однако часто он является слабо эффективным в силу обнаруженной у листерий способности переходить в некультивируемое состояние. Перспективнее всего применение ПЦР с использованием праймеров на основе последовательностей гена листериолизина О (hly) или фосфолипазы (plcA). Данный подход позволяет в 3 раза сократить число культур, изначально идентифицированных как L. monocytogenes, а так же обнаружить в продуктах листерии, находящиеся в некультивируемом состоянии (Ефимочкина, 2005). Метод обладает высокой чувствительностью и позволяет выявить возбудитель в течение нескольких часов, однако он является довольно дорогостоящим, что ограничивает его применение в большинстве современных лабораториях.
На современном этапе разработки методов исследования необходимо обратить внимание на биотические факторы (факторы стимуляции роста и размножения), способные дать толчок для разработки простых, не дорогих и эффективных методов выделения и идентификации листерий в пищевых продуктах.
- Влияние метаболитов на процессы размножения L. monocytogеnеs при разных температурах культивирования
На продуктах питания листерии обитают в сообществе с сапрофитной микрофлорой, вступая в определенные связи и взаимоотношения с ней.
Так, итальянские ученые смоделировали взаимодействие бактерий в мясопродуктах, при котором сроки хранения сосисок и салями увеличиваются (New Scientist, 2008). Отличительной особенностью модели итальянских ученых является не только влияние простых факторов: наличие пищи, влажность, температура и уровень кислотности среды, но и учет конкуренции за ресурсы, которая возникает между различными видами бактерий внутри одного продукта. При помощи новой модели исследователи изучали развитие микроорганизмов внутри салями во время процесса ее приготовления. В качестве конкурента Listeria monocytogenes выступали молочнокислые бактерии.
Это еще раз, хотя и косвенно доказало, что одним из механизмов, оказывающих влияние на рост листерий, может быть действие метаболитов, стимулирующих размножение бактерий (Николаев, 1996; Ильинская 2002).
В связи с этим целью нашей работы являлось изучение влияния метаболитов штаммов сопутствующей флоры пищевых продуктов на рост и размножение Listeria monocytogenes на продуктах питания.
Для решения данной проблемы методом прямого смыва с поверхности продуктов (сыр «Российский», сосиски свиные, креветка) были получены 67 штаммов сопутствующих сапрофитных микроорганизмов. Для выяснения способности метаболитов данных культур стимулировать рост и размножение листерий применяли метод прямого культивирования (скрининг-метод) (сапрофит сеяли ковриком на чашку, фильтровальные диски, пропитанные культурой испытуемых листерий 109 укладывали на поверхность среды другой чашки, скрепляли чашки друг напротив друга скотчем) при температурах 22˚С и 6˚С. В результате оценки взаимодействия микроорганизмов через продуцируемые летучие метаболиты были отобраны два штамма смытых с поверхности сыра (№7 и №8), стимулирующих рост листерий при 6˚С и 22˚С соответственно.
Методом фильтрации были получены метаболиты изолированных штаммов в стадии активного роста периодического культивирования и применены в ходе дальнейших исследований.
- Не культивируемые формы листерий
При переходе во внешнюю среду из организма человека или животного или при резком изменении условий существования в этой среде патогенные бактерии с помощью различных сенсорных и регуляторных механизмов перестраивают работу своего генетического аппарата, что позволяет им сохранять свою жизнеспособность. В настоящее время накоплено достаточно данных, свидетельствующих о способности не спорообразующих бактерий к длительному существованию во внешней среде в виде клеток со значительно сниженной метаболической активностью, не обнаруживаемых традиционными методами лабораторного культивирования на питательных средах. Таким образом, не культивируемыми (НФ) называют такие формы микроорганизмов, которые в ответ на действие неблагоприятных факторов прекращают рост на питательных средах, но сохраняют жизнеспособность, а при улучшении условий культивирования возобновляют пролиферацию. В настоящее время способность к переходу в не культивируемое состояние обнаружена у широкого круга микроорганизмов, в том числе и у листерий.
Необходимо отметить, что на продуктах питания возможно существование листерий в не культивируемом состоянии, что подтверждается низким процентом высеваемости при использовании стандартных бактериологических методов и сред. Есть данные, что присутствие не культивируемых форм листерий на продуктах питания подтверждалось методом ПЦР. Так, исследование нами 50 проб продуктов дало нулевой процент высеваемости листерий, однако при проведении генетического исследования было обнаружено 8 образцов, контаминированных некультивируемыми формами листерий, что составило 16% от общего количества образцов.
Ранее предполагалось, что температура является основным фактором, индуцирующим образование НФ. Однако переход в НС зависит не только от температуры культивирования, но и от вида микроорганизма, его физиологического состояния, сопутствующих факторов. Даже незначительные вариации химического состава среды при оптимальной температуре могут индуцировать переход в НС.
Долгое время биологические индукторы НС оставались неизвестны. Но появились немногочисленные экспериментальные данные, свидетельствующие о важной роли биотических факторов в образовании НФ. Так, Listeria monocytogenes в ассоциации с зелеными водорослями или в присутствии их экзометаболитов значительно быстрее переходили в НС, чем в контроле (Пушкарева В. И., Емельяненко Е. Н., Диденко Л. В.).
Мы осмелились предположить, что в процессе жизнедеятельности некоторые сапрофитные бактерии, обитающие на продуктах питания, могут выделять вещества не только усиливающие рост и размножение симбионтов, изменяющие экспрессию их биологических свойств, но так же и индуцирующие реверсию штаммов Listeria monocytogenes в культивируемое состояние.
Восстановительным культивированием (по Мукомоловой) с метаболитами ранее полученных культур сапрофитов переводили не культивируемый штамм Listeria monocytogenes NCTC 4b в культивируемое состояние и проверяли изменение морфологических, биологических и вирулентных свойств.
В результате только один штамм №7 (холодовой!!!) индуцировал реверсию не культивируемого штамма. Достоверность результата подтверждена генетически.
Важно отметить, что колонии листерий приобрели нехарактерную (по сравнению с контролем) морфологию. Они стали значительно крупнее в диаметре (до 0,5-0,8 мкм), имели ровный край, выпуклый центр, слизистую консистенцию, кремовато-белую окраску. Отсутствовал специфический запах, характерный для листерий, что косвенно свидетельствовало об изменении продуктов метаболизма.
Анализ измененных свойств листерий показал утрату способности ферментировать L(+) рамнозу, D(+) ксилозу, маннозу, манит в течение 7 суток, отсутствие подвижности при 22˚С, замедленную способность индуцировать лецитиназу как в присутствии угля, так и без него (на 4-е сутки), значительное снижение вирулентности (LD50 - 6,8х107). Однако в отличие от исходного штамма наблюдалось ярко выраженное увеличение зоны гемолиза (почти a-гемолиз), что свидетельствует об усилении гемолитической активности восстановленного штамма.
Для восстановления первоначальных свойств листерий провели пассирование в триптиказо-соевом бульоне с дальнейшим высевом на чашки с агаром КД для листерий. После 3 пассажа наблюдали постепенное изменение морфологии колоний и появление способности разлагать рамнозу и маннозу. Полное восстановление свойств, характерных для исходного штамма Listeria monocytogenes NCTC 4b наблюдали после 5 пассажа на питательных средах.
Проводится идентификация выделенных штаммов сапрофитных микроорганизмов.
Заключение
Таким образом, на уровне тест – микроорганизмов мы нашли вещество, способное стимулировать рост и переход бактерий Listeria monocytogenes в культивируемое состояние. Следующим этапом исследований должно быть получение данного фактора стимуляции роста, которое можно будет использовать в диагностике, посредством добавления его в среды накопления для листерий. Дальнейшая разработка диагностических систем с использованием данного фактора роста позволит ускорить этап выделения и идентификации бактерий Listeria monocytogenes, в том числе и на продуктах питания, что с успехом можно применять в санитарно – медицинской практике и на производстве.
Т.А. Кузнецова