Дальневосточный федеральный университет дальневосточный институт инновационных технологий и качества академия экологии, морской биологии и биотехнологии

Вид материала

Документы

Содержание Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes L. monocytogenes Listeria monocytogenes Modiolus kurilensis M. kurilensis M. kurilensis A. broughtoni Modiolus kurilensis S. pneumoniae S.  pneumoniae S. pneumoniae

Подобный материал:

• Дальневосточный федеральный университет, 61.97kb.
• А. Н. Малютин Дальневосточный морской биосферный государственный природный заповедник, 110.71kb.
• Положение о магистратуре федерального государственного автономного образовательного, 418.7kb.
• Правлением ОАО «Дальневосточный банк», 78.08kb.
• Совершенствование управления качеством при формировании интегрированных систем менеджмента, 270.66kb.
• Дальневосточный государственный университет восточный институт, 1418.89kb.
• 1. Общие положения, 275.75kb.
• «Менеджмент систем качества», 50.31kb.
• 14. дальневосточный экономический район, 1428.3kb.
• Программа I краевого съезда учителей и преподавателей математики хабаровского края, 344.82kb.

Глава 8. ИЗМЕНЧИВОСТЬ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ LISTERIA MONOCYTOGENES ПОД ДЕЙСТВИЕМ АБИОТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ НА ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ


Среди пищевых инфекций серьезную озабоченность в настоящее время вызывает листериоз. Известно, что Listeria monocytogenes – обладает психрофильными свойствами, что позволяет микроорганизму накапливаться в пищевых продуктах в условиях низкотемпературного хранения, сохраняя и даже повышая вирулентность (Бузолева, 2004). В литературе отсутствуют данные по изучению сочетанного действия вакуума, температуры и вида продукта на изменение биологических свойств листерий. Поэтому целью настоящей работы являлось изучение влияния абиотических (температура, вакуум, вид продукта-субстрата) факторов на размножение и биологические свойства L. monocytogenes при культивировании на пищевых продуктах.

Для эксперимента были взяты продукты, приобретенные в торговой сети г. Владивостока, наиболее эпидемически значимые при листериозе (Тартаковский, 2002): сосиски свиные и сыр «Камамбер», упакованные под вакуум на производстве, креветки вареные. Для лабораторных исследований использовали музейные штаммы L. moпocytogeпes типичные по своим культурально - морфологическим, биохимическим и антигенным свойствам сероварианта 4b: 132 , 152 , 148. Под парафин стерильным шприцем в асептических условиях вводили по 0,5 мл суспензии листерий в концентрации 10⁹ КОЕ/мл. Срок экспозиции составлял 30 дней, температура культивирования - 6˚С (холодовой вариант) и 22˚С (тепловой вариант). Биологические свойства листерий определяли в соответствии с МУ 4.2.1122-02.

В результате экспериментальных исследований установлено, что действие абиотических факторов приводит к изменению биологических и вирулентных свойств листерий.

Так, тепловые варианты, включая те, которые выращивали в вакууме, независимо от штамма и субстрата, утратили подвижность при 22˚С, в отличие от холодовых вариантов, что подтверждают данные литературы (Сомов, Бузолева, 2004). Из всех холодовых вариантов лишь штамм, культивируемый на креветке, был неподвижен при 22˚С. Возможно, что на подвижность листерий кроме температуры так же влияет и вид продукта, которые они контаминируют.

Все тепловые штаммы утратили гемолитическую и лецитиназную активность. Из холодовых, лишь штаммы, культивируемые на креветке и сыре, не лизировали эритроциты и не продуцировали лецитин.

Показано, что выращивание в вакууме не зависимо от температуры культивирования, усиливало адгезию листерий к эритроцитам. Из холодовых вариантов лишь штамм, культивируемый на креветке, незначительно повысил адгезивность. По данным Е. А. Зайцевой (2006), в холодных условиях адгезивные свойства у большинства штаммов листерий снижаются. В наших экспериментах в результате сочетанного действия вакуума и низкой температуры на листерии наблюдали повышение их адгезивных свойств.

Каталазная, оксидазная, гиалуронидазная активность, а также тинкториальные свойства и цитопатогенное действие листерий в эксперименте не изменялись.

При изучении сочетанного действия условий вакуума и низкой температуры было показано, что вирулентность L. monocytogenes повышается, при этом значения LD₅₀ уменьшались на два порядка по сравнению с контролем. Во всех остальных вариантах происходило снижение вирулентности, при этом значения LD₅₀ увеличивались на один - два порядка.

Под действием абиотических факторов изменялись биохимические свойства листерий. Характер изменений в большей степени зависел от субстрата и температуры культивирования штаммов. Так, наибольшие изменения (в сторону усиления ферментативной активности) наблюдали у тепловых вариантов, культивируемых на сыре, наименьшие – у холодовых на сосисках. При культивировании на сыре при 22˚С отмечено усиление способности ферментировать сахарозу, мелезидозу, раффинозу, инулин, сорбозу.

Изменчивость антигенных свойств листерий определяли по изменению их антибиотикочувствительности. Так, независимо от субстрата и условий культивирования у всех штаммов наблюдалось снижение антибиотикочувствительности, вплоть до приобретения устойчивости к цефалоспоринам и фторхинолонам III поколения. штамма2фалоспоринам l ии на пищевых продуктах значительно снижалась чувствительность ( до полной устойчивости) к цефтри Известно, что штаммы L. monocytogenes способны образовывать капсулу в условиях экстремального существования (длительное обитание в морской воде, почве) (Сомов, Бузолева, 2004). Возможно, что хранение контаминированных листериями продуктов в вакуумных упаковках способствует формированию капсулы у возбудителя.

Углубленное изучение биологических свойств возбудителя листериоза на современном этапе является весьма актуальным, так как открывает дополнительные возможности для разработки новых методов профилактики и предупреждения заболевания.


Библиографический список

1. Бузолёва Л. С. Адаптация патогенных бактерий к абиотическим факторам окружающей среды : автореферат дис. д-ра биол. наук.- Владивосток, 2001. - С. 48.
   
2. Зайцева Е. А., Сомов Г. П. Влияние температуры на адгезивные свойства листерий // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. - 2006. - № 3. - С. 20– 23.
   
3. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Организация контроля и методы выявления бактерий Listeria monocetogenes в пищевых продуктах : МУ 4.2.1122-02 : [утв. Главным санитарным врачем РФ 22.04.2002.]
   
4. Сомов Г. П., Бузолёва Л. С. Адаптация патогенных бактерий к абиотическим факторам окружающей среды. – Владивосток : ОАО Примполиграфкомбинат, 2004. – 167 с.
   
5. Тартаковский И. С., Малеев В. В., Ермолаева С. А. Листерии: роль в инфекционной патологии человека и лабораторная диагностика. - М. : Медицина для всех, 2002. – 200 с.
   

И. А. Теркина


Глава 9. АКТИНОМИЦЕТЫ ОЗЕРА БАЙКАЛ, КАК ПЕРСПЕКТИВНЫЕ ИСТОЧНИКИ БИОЛОГИЧЕСКИ-АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ


Из донных осадков и воды озера Байкал было выделено 154 изолятов актинобактерий. Показано, что 34 штамма актинобактерий продуцируют соединения, обладающие антимикробной активностью. Для 14 штаммов определены оптимальные условия синтеза антибиотиков. Большинство из полученных соединений исследованных актинобактерий проявляли специфическую активность только по отношению к грамположительным тест-культурам: Bacillus subtilus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faеcalis, Listeria zeeligery. Только один штамм ингибировал рост Candida albicans. Наибольшая антикандидозная активность отмечена для актинобактерий, культивируемых на синтетических средах. Показано, что выделенные штаммы синтезируют соединения с высокой ингибиторной активностью по отношению к патогенным бактериям: Listeria monocytogenes, Listeria ivanovi и Staphylococcus aureus. В то же время эти соединения не подавляли рост Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Yersinia pseudotuberculosis , Salmonella enteritidis, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa. Установлено, что исследуемые штаммы не продуцировали соединения с цитотоксической активностью по отношению к мышиным эритроцитам. Среди тестируемых микроорганизмов выявлены продуценты ингибиторов ферментов 1®3-b-D-глюканазы LVI из кристаллического стебелька Spisula sachalinensis и арилсульфатазы из брюхоногого моллюска Littorina kurila.


Работа поддержана грантами РФФИ № 03-04-49528 и 02-04-49517; грантом Президента Российской Федерации № 1237.2003.4; грантом № 04-1-0-05-005 Президиума Российской Академии Наук “Молекулярная и клеточная биология”; грантом ДВО РАН № 04-2-0-00-023 и Интеграционным грантом ДВО РАН и СО РАН, № 58.


Л.С. Бузолева


Глава 10. ВЛИЯНИЕ ХОЛОДОВОГО ОБОГАЩЕНИЯ НА СИНТЕЗ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ У ВОЗБУДИТЕЛЕЙ САПРОЗООНОЗОВ


Известно, что для успешного выделения возбудителей сапрозоонозов листерий и иерсиний, как из внешней среды, так и от теплокровного организма, в бактериологической практике широко используется холодовое обогащение исследуемого материала. Как правило, высеваемость этих микроорганизмов значительно повышается после 30 суточного выдерживания инокулята в среде Петерсона Кука при низкой температуре (6-8⁰С). В связи с этим, целью исследования являлось выявление факторов, способствующих ускорению размножения листерий и иерсиний в условиях низкой температуры в среде обогащения.

Для экспериментальных исследований использовали фильтраты культуральной жидкости от Listeria monocytogenes и Yersinia pseudotuberculosis, выращенных при температуре 37⁰С и 6-8⁰С в среде Петерсона Кука, взятых на разных стадиях периодического роста. Биологическую активность веществ «холодовых» и «тепловых» вариантов культуральной жидкости проверяли на тест культурах: Salmonella enteritidis, Staphylococcus aureus, E.coli, Pseudomonas aeruginosa , которые выращивали при 37⁰С и 6-8⁰С.

В результате проведенных исследований было установлено, что метаболиты листерий, выращенных при 37⁰С, не оказывали стимулирующего действия на размножение самих листерий, а также сальмонелл, псевдомонад и иерсиний ни при 37⁰С ни при 6⁰С, но усиливали скорость размножения E.coli в 3 раза, а Staphylococcus aureus в 6 раз при 37⁰С.

Тепловые метаболиты иерсиний стимулировали размножение самих себя при температуре 37⁰С в 2 раза, сальмонелл, кишечной палочки, псевдомонад, стафилококка в 3 раза, а листерий в 5 раз. При 6⁰С усиления роста тест микроорганизмов на тепловых метаболитах иерсиний не наблюдали.

При этом следует отметить, что стимулирующим действием обладали метаболиты исследуемых бактерий, взятых в логарифмической стадии роста при 37⁰С, для метаболитов стационарной фазы не было установлено такого факта.

«Холодовые» метаболиты листерий, взятые на 30-40 сутки роста культуры, стимулировали рост сальмонелл, стафилококка и самих листерий при 6⁰С в 2-3 раза, и не усиливали рост таких тест микроорганизмов как иерсинии и псевдомонады. «Холодовые » метаболиты иерсиний, взятые на 30-40 сутки роста культуры, стимулировали рост только иерсиний при 6⁰С и не стимулировали рост остальных тест микроорганизмов.

Таким образом, «тепловые» и «холодовые» метаболиты иерсиний и листерий отличаются по их воздействию на рост тест микроорганизмов. У «тепловых» стимулирующий фактор выделяется в культуральную среду в логарифмической стадии роста, у «холодовых» - в стационарной.


А.В. Гринченко, В.В. Кумейко


Глава 11. АКТИВНОСТЬ АГГЛЮТИНИРУЮЩИХ ФАКТОРОВ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА ДВУСТВОРЧАТЫХ МОЛЛЮСКОВ MODIOLUS KURILENSIS И ANADARA BROUGHTONI
ИЗ НЕКОТОРЫХ АКВАТОРИЙ ЯПОНСКОГО МОРЯ


Иммунология – одна из наиболее интенсивно продвигающихся областей биологии и медицины, с развитием которой связано много перспектив. В частности, исследования в этой области могут способствовать развитию марикультуры, а также разработке удобных методов экологического мониторинга, поскольку иммунный статус является показателем состояния животных, в том числе и морских гидробионтов. Modiolus kurilensis и Anadara broughtoni – двустворчатые моллюски, у которых почти не исследована иммунная система. В то же время, данные виды имеют важное промысловое значение. Двустворчатые моллюски является источником многих биологически активных веществ, а также ценным пищевым продуктом, имеющим спрос на ближайших рынках сбыта – Китае и Японии. Кроме того, в нашем регионе есть все условия для культивирования этих видов.

В данной работе проводилось определение интервала естественной вариации титра агглютининов гемолимфы M. kurilensis и A. broughtoni как основного показателя гуморального звена иммунитета моллюсков. Гемолимфа M. kurilensis была собрана в мае-июне 2006 года и в тот же период 2007 года во время экспедиций в бухте Троица, заливе Восток и бухте Киевка. Все указанные акватории слабо подвержены антропогенному влиянию, и целью работы являлось сравнение иммунного статуса животных из различных фоновых акваторий для выявления границ нормы. Гемолимфа A. broughtoni была собрана 20 марта и 4 мая 2009. Животных собирали на акватории Амурского залива с целью оценки сезонной динамики нормальной активности гуморального иммунитета.

Для исследования гуморального иммунитета моллюсков была проведена реакция прямой гемагглютинации. Необходимо отметить, что методики постановки реакции в разные годы несколько отличались: в 2006 г. использовали нативную плазму и фиксированные глютаровым альдегидом трипсинизированные и не трипсинизированные эритроциты (Эр) групп крови человека О, А, В, АВ и Эр барана; в 2007 г. плазму подвергали заморозке в жидком азоте, а агглютинируемыми частицами были нативные Эр четырех групп крови человека. В 2009 году в работе с A. broughtoni также использовали замороженную плазму, а Эр использовали как нативные, так и обработанные описанным выше способом.

Большинство работ по изучению гуморального иммунитета моллюсков рассматривает либо химическую структуру и специфичность растворимых агентов гемолимфы, либо изменение их концентраций в ответ на искусственное введение антигенов (АГ). Встречаются работы, в которых производится сравнение иммунных реакций между разными видами, но по изучению естественной вариабельности иммунного статуса внутри популяций и, тем более, по сравниванию между разными популяциями работ практически нет.

В ходе 2006 г. была апробирована и отработана сама методика постановки реакции. Было отмечено присутствие у некоторых животных микрофитобионтных инвазий: у шести представителей M. kurilensis со станции «Троица» в органах (гонада, пищеварительная железа (ПВЖ), мантия) и/или гемолимфе были обнаружены микроводоросли. Определить выраженную корреляцию между активностью гуморальных реакций иммунитета и наличием микрофитобионта в организмах моллюсков не удалось. Однако это лишь указывает на необходимость более глубокого исследования данного явления.

Наибольший интерес представляют собой результаты, полученные при сравнении суммарных показателей гемагглютинации с исследованиями по выявлению у модиолусов различных гистопатологий (результаты любезно предоставлены Сясиной И.Г., ИБМ ДВО РАН). В ходе сравнительного анализа было выявлено, что наличие патологических изменений органов, в виде аномальной вакуолизации клеток ПВЖ и деструкции клеток почечных канальцев, сопровождается заниженным титром гемагглютинации. Для доказательства непосредственной связи этих двух фактов был рассчитан коэффициент корреляции, который составил –0,578. Данное значение подтверждает наличие корреляции.

По результатам работ с M. kurilensis в 2007 г. можно с уверенностью сказать, что наиболее активно реакция прямой гемагглютинации проходила с Эр групп О и А для представителей со всех станций. Кроме того, данные говорят о схожести иммунного статуса животных из различных акваторий, собранных в один и тот же период.

В работе 2009 г. на A. broughtoni было установлено, что наибольшая активность агглютинирующих факторов проявляется в отношении Эр группы крови АВ, а наименьшая – к Эр группе О. Кроме того, сезонные сравнения показали изменение активности агглютинирующих факторов: титры реакции с плазмой животных, взятых в низкотемпературный период, ниже, чем таковые у животных в период активации метаболизма, вызванных повышением температуры до устойчивых положительных значений (+5 – +7^оC). Этот факт необходимо учитывать при оценке иммунного статуса этих животных.

Все полученные данные могут позволить разработать метод диагностики состояния здоровья M. kurilensis и A. broughtoni в естественных и культивируемых популяциях.

Работа поддержана Государственным контрактом с Федеральным агентством по науке и инновациям № 02.740.11.0292.


Ю.Н. Сокольникова, В.В. Кумейко


Глава 12. ПОКАЗАТЕЛИ ФАГОЦИТОЗА ГЕМОЦИТОВ ДВУСТВОРЧАТЫХ МОЛЛЮСКОВ MODIOLUS KURILENSIS ИЗ НЕКОТОРЫХ АКВАТОРИЙ ЯПОНСКОГО МОРЯ С НЕЗНАЧИТЕЛЬНОЙ АНТРОПОГЕННОЙ НАГРУЗКОЙ


Двустворчатые моллюски обладают гемальной системой циркуляции внутренней среды, которая сообщается с интерстициальными компартментами и формирует единую транспортно-защитную ткань, называемую гемолимфой, реагирующую на любые изменения, происходящие в окружающей среде. Важную роль в адаптивных и защитных реакциях животных играет фагоцитоз: как фактор клеточного иммунитета он отвечает за поглощение и удаление чужеродных агентов из организма. Ввиду активного развития аквакультуры и промысла ценных пищевых объектов, изучение защитных и адаптационных механизмов морских животных, в т.ч. моллюсков, актуально и необходимо. Modiolus kurilensis в силу его широкого распространения в Японском море также может являться удобным модельным объектом для мониторинговых исследований морских экосистем.

Данное исследование выполнено с целью оценки показателей фагоцитоза гемоцитов моллюсков из акваторий Японского моря как метода исследования активности клеточного иммунитета этих животных, а также оценки физиологического состояния двустворчатых моллюсков M. kurilensis при средне-нормальном фоне естественных патогенов.

Для исследования фагоцитоза определяли два показателя: фагоцитарную активность (ФА) – количество фагоцитирующих клеток и фагоцитарный индекс (ФИ) – среднее количество бактерий, поглощенных клеткой. Для достижения этой цели клеточные суспензии гемолимфы инкубировали с заранее термически убитыми и мечеными флуоресцирующим красителем FITC бактериями: Listeria monocytogenes, Pseudomonas fluorescens, Staphilococcus aureus. Затем препараты заключали в гидрофильную среду Mowiol 4.88 и анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Carl Zeiss Axioimager.

Раннее полученные нами данные по исследованию фагоцитарных свойств гемоцитов у M.kurilensis, собранных в бухте Троицы за 2006 год, показывают, что фагоцитарный индекс и фагоцитарная активность в отношении трех бактерий Listeria monocytogenes, Pseudomonas fluorescens и Staphylococcus aureus незначительно варьируют. В связи чем, для сравнения показателей фагоцитоза у модиолусов, взятых с трех станций (б. Троицы, б. Киевка и зал. Восток), нами было принято решение использовать в качестве чужеродного агента при подсчете данных лишь одну бактерию – Staphylococcus aureus.

Известно, что фагоцитарной активностью обладают не все типы гемоцитов моллюсков. По нашим данным у животных, собранных с трех станций, от 46 до 59 % гемоцитов M. kurilensis проявляют фагоцитарную активность.

При вскрытии моллюсков и дальнейшем исследовании у шести особей моллюсков, собранных в бухте Троицы, была обнаружена инвазивность тканей микроводорослями. У модиолусов с интенсивной тканевой инвазивностью микроводорослями (заражением охвачены гонада, мантия, ПВЖ) фагоцитарные показатели максимальны или приближаются к таковым. Моллюски, у которых микроводоросли выявлялись только в гемолимфе, имели средние фагоцитарные значения. Данная вариабельность, вероятно, связана с различным иммунологическим состоянием животного (активированное или угнетенное). У ряда моллюсков из бухты Киевка и залива Восток инвазии микроводорослей были выявлены лишь в гемолимфе, и ввиду этого, фагоцитарные показатели имеют различные значения. Особи, имеющие инвазии, равномерно располагаются по всей длине ранжированного ряда. Выраженной корреляции между показателями фагоцитоза и обнаруженной микрофитобионтной инвазией не выявлено, что, вероятно, может быть связано с необходимостью регистрировать степень выраженности и время развития инвазии.

Сравнение результатов по гистопатологическим изменениям в пищеварительной железе и почках, любезно предоставленных И.Г. Сясиной (ИБМ ДВО РАН), с полученными нами фагоцитарными показателями показало, что животные с гистопатологиями имеют невысокие показатели ФА и ФИ. Выявлена обратная коррелятивная связь между наличием патологий и показателями фагоцитоза, которая характеризуется для выборки из залива Восток как значительная и составляет – 0,51.

Средние значения фагоцитарной активности и фагоцитарного индекса незначительно дифференцируют три исследованные выборки и составляют 51,3±6,77 и 2,24±0,64, соответственно.

Результаты работы являются шагом к разработке метода диагностики физиологического состояния двустворчатых моллюсков в природе и аквакультуре, а кроме того, позволяют оценить естественную вариативность показателей иммунитета этих животных и установить в дальнейшем границы нормы и патологии для исследованных морфофункциональных изменений.

Работа поддержана Государственным контрактом с Федеральным агентством по науке и инновациям № 02.740.11.0292.


А.А. Анисимова


Глава 13. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ПРОТОЧНОЙ ЦИТОФОТОМЕТРИИ ДЛЯ ОЦЕНКИ ПРОЛИФЕРАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ ГЕМОЦИТОВ И ДИАГНОСТИКИ ГЕМОЦИТАРНОЙ НЕОПЛАЗИИ У ДВУСТВОРЧАТЫХ МОЛЛЮСКОВ


Двустворчатые моллюски – объект, который часто используется в различных исследованиях, в т. ч. в целях биоиндикации и оценки качества среды. Это связано с тем, что двустворчатые моллюски являются фильтраторами морской воды и накапливают в своих тканях всевозможные мутагенные токсины, содержащиеся в среде их обитания. В результате генотоксического эффекта среды у животных развиваются различные патологические состояния, которые могут свидетельствовать о неблагоприятной экологической обстановке в данной акватории. Учитывая, что моллюски выступают как ценный объект промысла и аквакультуры во многих странах мира, оценка физиологического состояния этих гидробионтов, включая диагностику различных заболеваний, стала актуальной задачей для всех приморских регионов, экономика которых так или иначе связана с культивированием морских организмов.

Одним из наиболее чувствительных критериев, отражающих физиологическое состояние моллюсков, является изменение пролиферативной активности клеток гемолимфы, связанное с нарушениями клеточного (митотического) цикла гемоцитов и приводящее к опасному заболеванию – гемоцитарной неоплазии, сходной по своим проявлениям с лейкемией позвоночных животных. Ее распространение среди коммерчески значимых видов достаточно велико. Поражение и смертность в культивируемых популяциях моллюсков (до 95 %) наносит значительный экономический ущерб марикультурным хозяйствам. Во многих странах имеются лаборатории, занимающиеся проблемой гемоцитарной неоплазии двустворчатых моллюсков. На Дальнем Востоке России, несмотря на широкий охват огромной акватории Северной Пацифики, такие исследования единичны. Сотрудниками Института биологии моря ДВО РАН выявлены опухоли у некоторых видов двустворчатых моллюсков (модиолус, мидия, гребешок), обитающих в южной части Приморья (Usheva, Odintsova, 1997; Usheva, Frolova, 2000). Среди них зарегистрированы и случаи гемоцитарной неоплазии.

Механизмы возникновения и прогрессии опухолевого роста до сих пор до конца не поняты. Согласно господствующей теории, в нормальной клетке имеются эндогенные протоонкогены (гены инициации и прогрессии клеточного цикла), которые под действием мутаций превращаются в онкогены, что приводит к перерождению нормальных клеток в опухолевые. Мутации могут происходить как спонтанно, так и под воздействием мутагенных факторов – радиации, природных токсинов, тяжелых металлов, антропогенной органики и т.д. В качестве онкогенов могут выступать и экзогенные вирусы при внедрении их в геном эукариотической клетки.

Трансформированные (неопластические) клетки характеризуются бесконтрольным ростом, способностью проникать (метастазировать) в здоровые ткани, увеличением содержания ДНК в результате полиплоидизации клеток или, наоборот, его уменьшением в ходе апоптоза.

Диагностировать гемоцитарную неоплазию можно несколькими способами. Один из методов, применяемых в диагностических лабораториях, – гистологический анализ тканей. На препаратах мазков гемолимфы раковые клетки моллюсков выглядят более крупными и имеют увеличенное ядро (из-за избыточности генетического материала). В клетках также могут регистрироваться митозы и апоптотические явления (Usheva, Odintsova, 1997; Galimany, Sunila, 2008). Отмечено, что на ранних стадиях развития гемоцитарной неоплазии процент апоптотических клеток выше, чем на более продвинутых стадиях, где в большей степени регистрируются полиплоидные клетки (Galimany, Sunila, 2008). Гистологический метод выявления опухолей часто дополняется методом хромосомного анализа. Выявление лишних хромосом (анеуплоидии) или целых хромосомных наборов (полиплоидии) позволяет предположить наличие неоплазии. Цитогенетический метод, как и гистологический, достаточно трудоемок и требует много времени для анализа.

Более удобным способом выявления клеток с измененным хромосомным набором (как с увеличенным в ходе полиплоидизации, так и с уменьшенным в ходе апоптоза) является метод проточной цитофотометрии. Этот метод позволяет произвести очень быстрый и точный анализ содержания ДНК в большом количестве образцов гемолимфы или других тканей. Проточная цитофотометрия опирается на измерения свойств клеток в «проточной системе», состоящей из специальным образом создаваемого потока жидкости, в который вводят клетки. В момент, когда клетки проходят через луч лазера, они рассеивают свет во всех направлениях и испускают небольшое количество света за счет флуоресценции. Для выявления анеуплоидных или полиплоидных клеток используют количественные флуоресцентные окраски на ДНК (DAPI, PI, ЕВ Хёхст и др.). Поскольку содержание ДНК в клетках меняется по ходу клеточного цикла (перед делением клетки оно удваивается), метод позволяет также выявить долю клеток на разных стадиях цикла, а также суммарный процент клеток, участвующих в данный момент в пролиферации. Если на однопараметрической гистограмме выявляется нетипично большой пик тетраплоидных клеток (больше ожидаемого числа нормальных предмитотических (G₂) и митотических (М) клеток) или регистрируются клетки других классов плоидности, подозревают наличие в исследуемой ткани опухолевой трансформации (Bihari et al., 2003; da Silva et al., 2005).

Если образцы одновременно окрашены на ДНК и на какие-либо специфические антигены (маркеры) клеточной пролиферации, то двумерные гистограммы позволяют анализировать динамику клеточного цикла и оценивать различные его параметры – такие как скорость деления клеток, время удвоения популяции опухолевых клеток, границы между фазами цикла и т.д. Так, для устрицы Crassostrea virginica при одновременном анализе содержания ДНК методом проточной цитофлуорометрии и иммуноцитохимическом определении экспрессии PCNA (ядерный антиген пролиферирующих клеток) на препаратах было показано, что клетки ротовой лопасти обладают более высокой пролиферативной активностью по сравнению с клетками других органов – мантии, жабер, глотки и пищеварительной железы (Jenkins et al., 2006). Подобные исследования позволяют отбирать определенные клеточные линии для использования показателя пролиферативной активности в качестве биомаркера при изучении воздействий стрессовых факторов на морские организмы.

Работа поддержана Государственным контрактом с Федеральным агентством по науке и инновациям № 02.740.11.0292.


Библиографический список

1. Bihari N., Micic M., Batel R., Zahn R. K. Flow cytometric detection of DNA cell cycle alterations in hemocytes of mussels (Mytilus galloprovincialis) off the Adriatic coast, Croatia // Aquatic Toxicology. - 2003. - Vol. 64. - P. 121-129.
   
2. Da Silva P. M., Soudant P., Carballal M. J., Lambert C., Villalba A. Flow cytometric DNA content analysis of neoplastic cells in haemolymph of the cockle Ceratoderma edule // Diseases of Aquatic Organisms. - 2005. - Vol. 67. - P. 133-139.
   
3. Galimany E., Sunila I. Several cases of disseminated neoplasia in mussels Mytilus edulis (L.) in Western Long Island Sound // Journal of Shellfish Research. - 2008. - Vol. 27, № 5. - Р. 1201-1207.
   
4. Jenkins J. A., LaPeyre J. F. Cell proliferation detected with flow cytometric cell cycle analysis and immunohistochemical detection of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) from somatic tissues of eastern oysters, Crassostrea virginica // Environmental Bioindicators. -2006. - Vol. 1, № 3. - Р. 177-190.
   
5. Usheva L. N., Odintsova N. A. Mesenchymal tumor in the mantle of the mussel Modiolus difficilis from Amursky Bay in the Sea of Japan // Diseases of Aquatic Organsms. - 1997. - Vol. 29. - P. 121-126.
   
6. Usheva L. N., Frolova L. T. Neoplasia in the connective tissue of the mussel Mytilus trossulus from polluted areas of Nakhodka Bay, Sea of Japan // Russian Journal of Developmental Biology. - 2000. - Vol. 31, № 1. - Р. 53-60.
   

А.В. Мартынова, А.П. Прушинский, Е.С. Носач, О.А. Чулакова


Глава 14. Разработка метода идентификации и генотипирования микроорганизмов-возбудителей инфекций респираторного тракта


Несмотря на достигнутые успехи, диагностика инфекций респираторного тракта до сих пор остается одной из наиболее значимых проблем здравоохранения. Во многом это связано как с отсутствием адекватных методов диагностики и идентификации возбудителей, так и с объективными причинами, такими как многообразие видового состава и принадлежность рассматриваемых микроорганизмов к группе прихотливых возбудителей.

Целью нашей работы являлось на примере Streptococcus pneumoniae, наиболее часто встречающегося патогена респираторного тракта, обосновать новый метод идентификации и генотипирования микроорганизмов- возбудителей инфекций респираторного тракта.

Методы: В качестве перспективного диагностического и молекулярно-эпидемиологического маркера штаммов S. pneumoniae изучен некодирующий участок ДНК SP_1922 и SP_1923, обозначенный как NCR (non-coding region). Охарактеризованы такие молекулярно-генетические особенности этого участка, как: фланкированность видоспецифичным геном (ген ply), приемлемый размер ампликона; а также наличие статистически значимой вариабельности рестрицируемых фрагментов.

Результаты: несмотря на значимость пневмококковых инфекций эпидемическая ситуация в отношении данной инфекции обусловлена во многом объективной сложностью микробиологической диагностики S. pneumoniae, не позволяющей до настоящего времени создать так называемый «золотой» стандарт диагностики, а также проводить мониторинг пневмококковых инфекций. Для решения данной задачи был применен метод анализа полиморфизма рестрикционных фрагментов NCR участка ДНК S. pneumoniae, где в качестве диагностической мишени был использован некодирующий фрагмент геномной ДНК S. pneumoniae, ранее не применявшийся в таком качестве.

Некодирующий фрагмент (NCR) геномной ДНК S. pneumoniae является видоспецифичным участком и обладает свойствами, объясняющими его использование в качестве оптимальной диагностической мишени для диагностики пневмококка, в связи с техническими преимуществами выполнения полимеразной цепной реакции, которые не были достигнуты при использовании других участков генома S. pneumoniae, такие как локализация изучаемого фрагмента в непосредственной близости от гена, кодирующего видоспецифический фактор вирулентности пневмококка- пневмолизин; консервативность фланкирующих их участков (SP1922 (гипотетический протеин) и SP1923 (пневмолизин)); наиболее приемлемый размер (1182 bp) выбранного ампликона; амплификация вариабельного участка генома.

В связи с применением для создания праймера новой диагностической мишени была изменена схема ПЦР реакции для оптимизации параметров ренатурации с целью увеличения выхода конечного ПЦР-продукта. В частности, мы пришли к выводу, что оптимальным числом циклов, обеспечивающих максимально возможный выход амплифицированного продукта, является 30; другие параметры не нуждались в оптимизации и были проведены согласно общепринятым правилам.

В результате серии проведенных опытов с использованием предложенного нами варианта ПЦР реакции праймер, созданный на основе последовательности NCR фрагмента, действительно оказался высокочувствительным и высокоспецифичным видовым маркером. Реакция была положительна как с контрольными, так и с референтными штаммами (R6, TIGR4), и она была отрицательна с близкородственными штаммами семейства стрептокококков, а также была отрицательна со штаммами, неродственными S. pneumoniae, но наиболее часто выделяемыми вместе с ним в составе ассоциаций микроорганизмов из клинических образцов.

Кроме того, чувствительность NCR фрагмента S.  pneumoniae не связана с серотиповой принадлежностью выделенного штамма. Проведенный количественный анализ ПЦР продукта показал отсутствие взаимосвязи, и вне зависимости от серотипа средний размер амплифицированного фрагмента составлял 1268 ± 6,57 пар оснований [1254,997-1281,603].

Выводы: в качестве перспективного диагностического и молекулярно-эпидемиологического маркера штаммов S. pneumoniae изучен некодирующий участок ДНК SP_1922 и SP_1923, обозначенный как NCR (non-coding region). Охарактеризованы такие молекулярно-генетические особенности этого участка, как: фланкированность видоспецифичным геном (ген ply), приемлемый размер ампликона; а также наличие статистически значимой вариабельности рестрицируемых фрагментов.


___________________________________________________________________________