Изучение кинетики вирус-клеточного взаимодействия с помощью флуореiентного маркера DND-167 при инфицировании вирусом гриппа культуры клеток MDCK
Дипломная работа - Медицина, физкультура, здравоохранение
Другие дипломы по предмету Медицина, физкультура, здравоохранение
Оглавление
1.Введение и обзор литературы
?Вирус гриппа
?Рецепторное взаимодействие вируса и клетки
?Цель работы
.Теоретическая часть
?Кинетическая модель связывания вируса с клеткой
?Кинетическая модель процесса эндоцитоза
?Конкурентная модель
.Материалы и методы
?Материалы
?Измерение параметра эффективности ингибитора (IC50) методом ФОЕ
?Метод иммуноферметного анализа
?Метод флуореiентной детекции
.Экспериментальная часть
?Данные, полученные методом ФОЕ
?Данные метода иммуноферментного анализа (ИФА) [41]
?Данные, полученные методом флуореiентной детекции
.Результаты
.Заключение
?Итоги работы:
?Выводы:
.Список литературы
1.Введение и обзор литературы
Вирус гриппа
Грипп - серьезное респираторное заболевание, поражающее ежегодно до 20% мирового населения. Во время пандемий гриппа, происходящих приблизительно каждые десять лет, высоковирулентные штаммы вызывают необычайно высокий уровень смертности, особенно у пожилых людей. Страшнейшая пандемия в истории, пандемия 1918 г. унесла жизни 20 млн. человек. Эпидемиологи полагают, что человечеству угрожает новая пандемия, которая может быть вызвана вариантами высоко-патогенных вирусов Н5, приобретшими способность передаваться человеку.
Вирус гриппа А имеет мембранную оболочку, внутри которой располагается вирусный геном, ассоциированный с белками. Оболочка частицы вируса гриппа, не содержащая клеточных белков, сформирована липидным бислоем плазматической мембраны, в котором находятся три интегральных белка: гемагглютинин (HA, до 500 копий на вирион), нейраминидаза (NA, около 100 копий на вирион) и белок ионного канала М2 [1-2]. Под оболочкой вириона располагается слой матриксного белка М1. В полости вириона локализуются 8 сегментов генома, представленного одноцепочечной РНК негативной полярности и кодирующего 10 вирусных белков, один из которых - неструктурный NS1. Вирусный геном ассоциирован с четырьмя белками (нуклеопротеин (NP), белки PB1, PB2 и PA), и формирует рибонуклеопротеиновые комплексы (частицы) [3-4]. Комплексы имеют вид палочковидных структур размерами 30-110нм. [5-6] и образованы спирально уложенными молекулами нуклеопротеина, вокруг которого обернута вирусная РНК [7] (Рисунок 1).
В состав каждого комплекса входит 37 - 97 молекул нуклеопротеина [4]. Под электронным микроскопом, при изучении методом негативного контрастирования, вирус гриппа А в суспензионных препаратах плеоморфен. Диаметр сферических частиц составляет 80 - 120 нм. Вирионы окружены отчетливой оболочкой, на которой видны шипики (spikes) длиной 10 - 14 нм и диаметром 4 - 6 нм [4],[8].
Первой и критической стадией инфекционного процесса является связывание вируса гриппа со специфическими рецепторами на поверхности клеток. НА необходим вирусу для узнавания и прикрепления к клетке-мишени, то есть он опосредует самую первую стадию инфекции. Клеточным рецептором, который связывается с гемагглютинином, является в первом приближении N-ацетилнейраминовая кислота (Neu5Aс), а точнее - некоторые сиалоолигосахариды. Кроме того, на следующем этапе НА обеспечивает проникновение вируса внутрь клетки, опосредуя слияние мембран вириона и клетки. Широко распространено мнение, что именно изменение специфичности связывания с рецепторами может быть тем механизмом, который приведет к появлению нового пандемичного штамма вируса гриппа [9-11].
Рецепторное взаимодействие вируса и клетки
Первые этапы вирусной инфекции, независимо от того, о каком вирусе идет речь, традиционно принято называть адсорбцией, проникновением и раздеванием (разрушением вирусной оболочки). Под адсорбцией принято рассматривать первичный контакт вируса с клеткой. Часто этот контакт сначала бывает очень слабым - обратимая адсорбция. Затем прочность контакта возрастает - необратимая адсорбция. Эти термины в равной степени применимы для описания начальной стадии проникновения в клетки любых вирусов. Вероятно, что во многих случаях имеет место процесс прикрепления вируса к клетке вследствие физико-химической комплиментарности между поверхностью вируса и молекулами рецепторов, находящихся на поверхности клетки, который индуцирует в клетке изменения, необходимые для проникновения в нее вируса [12]. Что же касается таких относительно больших белковых структур, как капсидные вирионы, то для них известен только один механизм проникновения в клетку - это рецепторно-опосредованный эндоцитоз. Возможно, что в образовании рецепторных связей принимают участие и ионы культуральной среды. Рецептором, как правило, служит расположенный на поверхности клетки белок или гликопротеин. На поверхности клетки имеются различные рецепторы, каждый из которых специфичен для своего вируса. Специфичность этих рецепторов не абсолютна, что приводит к возможности группировки вирусов по этому свойству в своеобразные семейства. Вирусы, родственные друг другу по данному признаку, могут быть родственны и по другим признакам, однако это условие не является обязательным. На поверхности единичной клетки может содержаться от 104 до 105 копий каждого вида рецепторов [13].
Следует подчеркнуть, что сам факт адсорбции вируса на клетке еще никоим образом не означает инициации вирусной инфекции. Связи, образующиеся при адсорбции между вирусом и клеткой, могут быть слабыми, а адсорбция обратимой, то есть ?/p>