Изучение кинетики вирус-клеточного взаимодействия с помощью флуореiентного маркера DND-167 при инфицировании вирусом гриппа культуры клеток MDCK
Дипломная работа - Медицина, физкультура, здравоохранение
Другие дипломы по предмету Медицина, физкультура, здравоохранение
для определения наличия антител или антигенов в крови или других биологических жидкостях в различных тест-системах. Наиболее распространенными объектами являются белки, их мембранные фракции, вирусные частицы, реже фиксированные клетки. Проведение кинетических исследований затруднено в силу большого количества стадий, необходимых по протоколу, после процесса непосредственного связывания антигена и антитела.
Особенностью методического подхода, реализованного в работе [41], является определение кинетических закономерностей вирус-клеточного взаимодействия вириона с модельными клеточными рецепторами (фетуин) и живыми чувствительными к вирусу гриппа клетками (MDCK).
Метод флуореiентной детекции
LysoSensor blue DND-167 Для наблюдения изменений, происходящих с клетками на первых стадиях проникновения вирусной частицы в клетку (Рисунок 4) применяли лизосенсор - рН-зависимый флюореiентный маркер DND-167, интенсивность флюореiенции которого увеличивается при понижении рН в месте связывания вируса с клеточными рецепторами и внутри эндосомы от нормального значения до рН ~5 (Рисунок 5).
DND-167 имеет большую ?-систему. В водной среде он может существовать как в виде положительно, так и отрицательных ионов. Концентрация каждой из его форм зависит от значения рН среды. При повышении рН он депротонируется превращаясь в отрицательный ион, при понижении соответственно, наоборот. Калибровочная зависимость интенсивности флюореiенции DND-167 от величины рН позволяет изучать кинетику лизосомальной активации клетки, индуцированной проникновением вируса в клетку.
Для проверки степени применимости красителя DND-167 к нашей задаче был снят спектр флуореiении для различных pH среды.
Измерения проводились спектрофлуориметре RF-520 (Shimadzu, Япония) (Рисунок 6). Для исследования изменения спектра флуореiенции было приготовлено четыре пробирки с разными пробами. Каждая проба помещалась во флуориметр, где в течение всего эксперимента облучалась одной и той же длиной волны (360нм.). При помощи флуориметра измерялся спектр эмиссии пробы в диапазоне 380-500 нм. (рабочий диапазон красителя LysoSensor Blue DND-167 по паспортным данным) (Рисунок 7).
Образцы DND167 приготовлены в фосфатно-солевом буфере (ФСБ), поддерживающем определённые значение рН. Для проведения эксперимента были выбраны следующие значения pH: 2, 4,3, 5,3, 6,4. pH измерялся при помощи pH метра PerpHecT METER (погрешность 0.05). Общая концентрация красителя во всех пробах была одинаковой.
Интенсивность флуореiенции прямо пропорциональна интенсивности поглощённого излучения и вероятности излучения кванта при переходе из возбужденного состояния в основное, то есть квантовому выходу флуореiенции:
Iфлуореiенции = Iпоглощённаяj ,
где j - квантовый выход флуореiенции.
Из представленных на рисунке 7 результатов видно, что спектры поглощения и флуореiенции зависят от значения рН. Отсюда можно сделать вывод о некоторых деталях механизма флуореiенции.
Зависимость интенсивности флуореiенции от рН:
Но квантовый выход флуореiенции j от рН не зависит, то есть:
Таким образом, показано, что уменьшение флуореiенции DND-167 при уменьшении рН вызвано не уменьшением квантового выхода, а уменьшением величины поглощения. Этот результат необходим для адекватной оценки полученных данных при работе с данным флуорофором на имеющемся оборудовании.
Также необходимо заметить, что длина волны пика флюореiенции (Рисунок 7) изменяется не более, чем на 4-5нм. и составляет , что является незначительным при сравнении с изменением интенсивности флуореiенции в пробах с различными pH.
TECAN Infinite 200 Разработанная в теоретической части работы кинетическая модель позволяет выделить два основных параметра, характеризующих взаимодействие вируса с клеткой - это константа диссоциации, константа проникновения и скорость изменения внутриэндосомальной рН. Экспериментальные исследования на монослое культуры клеток MDCK с использованием штамма вируса гриппа А/Aichi/2/68 и фетуина, молекулы-блокатора связывания вируса с клеткой, проводились на флуориметре TECAN серии Infinite 200 (Рисунок 8). Детектор в Infinite 200- ФЭУ, опционально чувствительный в УФ и красной областях; диапазон длин волн для измерения интенсивности флуореiенции: Ex 230 - 850 нм, Em 280 - 850 нм. (Рисунок 9); оптическая ширина щели Ex: 295нм.; диапазон измерения поглощения 0- 3OD с точностью < (1% + 0.010 OD). Температурный диапазон - 5С до 42С (поддерживается с точностью до 0.5 С).
При добавлении в лунку к окрашенному DND-167 клеточному монослою вирусной суспензии, происходит связывания вирионов с клеточными рецепторами за время порядка 5-10 минут, что приводит к пониженю pH в результате действия транс-мембранного потенциала и, как следствие, росту интенсивности флуореiенции лизо-сенсора. Из данных, полученных при изучении спектра флуореiенции красителя DND-167 (Рисунок 7), можно сделать вывод, что чувствительности прибора (0.5 fmol/лунка при измерении поверхностной флуореiенции) и точности измерения интенсивности флуореiенции TECAN Infinite 200 для каждой лунки планшета-96black, будет достаточно при изменении pH в диапазоне от 6 до 5 (что соответствует диапазону изменения pH на поверхности и в эндосоме клетки при проникновении вирусной частицы).
Во время снятия зависимости интенсивности флуореiенц?/p>