Изучение кинетики вирус-клеточного взаимодействия с помощью флуореiентного маркера DND-167 при инфицировании вирусом гриппа культуры клеток MDCK
Дипломная работа - Медицина, физкультура, здравоохранение
Другие дипломы по предмету Медицина, физкультура, здравоохранение
?верхностью клетки i=1,тАж,n раз. Анализ в случае наличия кооперативного связывания (в случае сильно выраженной положительной кооперативности) может быть сильно упрощен [38], если предположить, что кооперативное лиганд-рецепторное взаимодействие описывается схемой
Даже в равновесии и в случае очень сильных упрощающих предположений, уравнения на концентрации реагентов достаточны сложны.
Значения константы скорости ассоциации комплекса антиген-антитело опубликованные в научной литературе, колеблются от 106 до 108 М-1с-1. В то время как значения для константы скорости диссоциации комплекса антиген-антитело варьируются в больших пределах от 10-4 до 10000 с-1 [39]. Такая разница в разбросе значений для констант скоростей прямой и обратной реакций ведет к предположению, которое на сегодняшний день является общепризнанным взглядом: константы скорости прямой реакции связывания отличаются для разных молекул антигена и антитела несильно, а имеющиеся различия в константах связывания обусловлены в основном различиями в константе скорости диссоциации. Выражение для равновесной константы диссоциации легко получить из уравнения (учитывая (1.1)):
Особенностью методического подхода, реализованного в данной работе, является определение кинетических параметров вирус - клеточной системы с помощью детекции изменения pH при образовании вирус-рецепторного комплекса (необратимой адсорбции) и при проникновении вирусной частицы в эндосому клетки.
Цель работы
Целью данной работы является изучение кинетики активации клетки в результате рецептор-обусловленного эндоцитоза вирусной частицы. В ходе выполнения работы решались следующие задачи:
oРазработка нового метода исследования вирус-клеточного взаимодействия с применением флуореiентной детекции
oПостроение теоретической модели и разработка методики нахождения кинетических параметров вирус-клеточного взаимодействия и определения эффективности ингибитора с применением флуореiентной детекцииПрименение построенной теоретической модели для аппроксимации результатов кинетического экспериментаСравнение стандартных вирусологических (ФОЕ и ИФА) и нового флуореiентного методов оценки эффективности ингибитора
2.Теоретическая часть
Кинетическая модель связывания вируса с клеткой
(соответствие с условиями проведения эксперимента при 4?С)
Отличительной особенностью взаимодействия вируса с клеткой является фазовая гетерогенность системы. При связывании вируса гриппа с культурой клеток (моновалентная модель) схема реакции имеет вид, схожий со схемой связывания вируса гриппа с аналогом клеточного рецептора (белок фетуин):
где [V]- концентрация свободного вируса в суспензии
[R] - концентрация свободных рецепторов на поверхности клеток
[VR] -концентрация вируса на поверхности клетки, связанного с клеточными рецепторами
[V0,] [R0] - начальная концентрация вирусных частиц и клеточных рецепторов соответственно
k+, k- - кинетические константы связывания вируса гриппа с клеткой: ассоциации и диссоциации соответственно
kin - константа проникновения вируса внутрь клетки (константа эндоцитоза)
где (закон сохранения вещества для вирусных частиц и для рецепторов на поверхности клетки)
Приближения:
[R]>>[VR] ;
;
тогда дифференциальное уравнение примет вид:
откуда можно найти скорость изменения концентрации вируса на поверхности клетки:
Таким образом, концентрация вируса на поверхности клетки зависит как и от начальной концентрации вируса так и от концентрации рецепторов на поверхности клетки. А скорость насыщения зависит от начальной концентрации вируса в суспензии. На временах наступает насыщение клеточных рецепторов вирусом (уже со сделанной оговоркой, что [V0]<<[R0]) Т.е. на таких временах связывание вируса с клеточными рецепторами можно рассматривать как равновесный процесс.
Кинетическая модель процесса эндоцитоза
(соответствие с условиями проведения эксперимента при 37?С)
Одним из этапов заражения вирусом клетки является процесс эндоцитоза. Рассмотрим его в рамках кинетической модели. Этому посвящен ряд статей [39-40] и их модели заслуживают отдельного рассмотрения, но все они отличаются сложностью в обработке и расчете параметров взаимодействия вируса с живой клеткой (и имеют ряд приближений на этом этапе - этапе расчета параметров взаимодействия вируса с живой клеткой). Мы же попробуем создать упрощенную модель связывания вируса гриппа с живой клеткой, которая не будет требовать приближенных методов анализа и будет адекватно описывать связывание вируса с рецепторами и проникновение вируса внутрь. Поскольку только вирус, связанный с поверхностью клетки, способен проникнуть внутрь клетки, то разумно весь процесс первого этапа заражения вирусом клетки разбить на две последовательные реакции: связывание вируса с клеточными рецепторами и проникновение связанного вируса внутрь клетки (процесс эндоцитоза), или в виде схемы:
где [V]- концентрация свободного вируса в суспензии
[R] - концентрация свободных рецепторов на поверхности клеток
[VR]s/in -концентрация вируса на поверхности/внутри клетки, связанного с клеточными рецепторами
[V0,] [R0] - начальная концентрация вирусных