Изучение кинетики вирус-клеточного взаимодействия с помощью флуореiентного маркера DND-167 при инфицировании вирусом гриппа культуры клеток MDCK
Дипломная работа - Медицина, физкультура, здравоохранение
Другие дипломы по предмету Медицина, физкультура, здравоохранение
?ус. Вирус гриппа, штамм A/Aichi/2/68, получен из Института полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН, г. Москва, прошедший пять пассажей на лёгких мышей и один-два пассажа на культуре клеток MDCK. Гемагглютинирующая активность материала составляла 256 ед. Очистка и концентрирование вируса с помощью фильтра-концентратора Vivaspin 20 (300кДа) и центрифуги (4500 об/мин., 30 мин., t=4C)
2.Растворы для реакций
Раствор фетуина 0.1%-ный в фосфатном буферном растворе
Стандартный фосфатный буферный раствор (PBS - Phosphate Buffer Solution) в физиологическом растворе, поддерживающий рН 7,2
Питательная среда RPMI 1640.
Субстрат:{9ml. H2O +1ml. NaAc(0,5M) +60 mkl.H2O2+6mkg.OFD}
Флуореiентный краситель LysoSensor Blue DND-167
Измерение параметра эффективности ингибитора (IC50) методом ФОЕ
Метод ингибирования фокусообразующих единиц
В работе для измерения концентрации вирусных частиц использована методика связывания вируса с молекулами фетуина. Суть её заключается в следующем. Оболочечный белок вируса гриппа, гемагглютинин, имеет сродство к определённым клеточным рецепторам, сиаловым кислотам. Молекулы фетуина - это модель клеточного рецептора, к которому вирус также имеет специфичное сродство через взаимодействие с сиаловыми кислотами. Конъюгированный с ферментом фетуин при связывании с вирусными частицами позволяет количественно измерить концентрацию вирусных частиц по величине концентрации продуктов ферментативной реакции. По количеству вирионов на поверхности напрямую определяется концентрация вирусных частиц.
Алгоритм определения параметра IC50 методом фокусообразующих единиц (ФОЕ)
1.Готовится раствор фетуина (1мг/1мл PBS).
2.Добавляется в 96-луночные круглодонные стерильные планшеты по 100 мкл поддерживающей среды (ИГЛА ДМЕМ,100 ед/мл пенецилина,100 мкг/мл стрептомицина, 300 мкг/мл L-глютамин , 10 мкг/мл ДЕАЕ-декстрана (Sigma), 5 мкг/мл трипсина TPCK)
.Готовятся серийные двукратные разведений блокатора фетуин, начиная с разведения 1:20 путем переноса 50 мкл пробы в последующую лунку; из лунок последнего ряда удаляется 50 мкл после последнего разведения блокатора.
.Добавляется в лунки по 50 мкл вирусной суспензии, содержащей ~500 ФОЕ вируса; инкубируется 30 мин при температуре 35оC.
.Удаляется ростовая среда из лунок планшета с монослоем клеток MDCK; монослой двукратно промывается средой для разведения вируса. Перенос (после окончания инкубации) из планшета с разведениями сывороток по 100 мкл в соответствующие лунки планшета с монослоем клеток
.Инкубируется при 35 оC в течение 18 часов в CO2 атмосфере.
.Удаляется из планшета содержимое (без промывки), добавляется по 50 мкл охлажденного ацетона (80%) в каждую лунку; на 15 минут при комнатной температуре
.Промываюется планшет фосфатно-буферным раствором (ФБР) 2-3 раза по 200 мкл на лунку
.Готовится разведение 1:2000 моноклональных антител к белку NP вируса гриппа А (CDC, Atlanta, Lot 03-0325L) в ФБР, содержащем 1% бычьего сывороточного альбумина и 0.1% Твин 20, и по 50 мкл добавляется в каждую лунку. 35оC на 60 минут.
.Клетки промываются дистиллированной водой 2-3 раза по 200 мкл на лунку; удаляются лишние капли.
.Добавляется по 50 мкл на лунку раствора конъюгированных биотином антител кролика к иммуноглобулинам мыши (1/3000 в ФБР); на 30 минут при 35 оC.
.Клетки промываются дистиллированной водой 2-3 раза по 200 мкл на лунку.
.Добавляется 50 мкл на лунку раствора конъюгированного пероксидазой хрена стрептавидина (1/2000 в ФБР); на 30 минут при 35 оC.
.Клетки промываются дистиллированной водой 2-3 раза по 200 мкл на лунку.
.Добавляется в каждую лунку по 100 мкл раствора субстрата (9ml. H2O +1ml. NaAc(0,5M) +60 mkl.H2O2+6mkg.OFD); при комнатной температуре в темноте 30 минут.
.Планшет промывается под краном. В каждую лунку добавляется по 50 мкл дистиллированной воды.
.Подсчитываются под микроскопом образовавшиеся фокусные единицы (зараженные клетки) в каждой отдельной лунке.
Данные о количестве зараженных клеток позволяют построить зависимость числа инфицирования клеток от концентрации блокатора фетуин. С помощью полученной зависимости, определяется параметр IC50 - концентрация ингибитора, при которой число образовавшихся комплексов равно половине от числа комплексов в случае отсутствия конкурента ([IC50]=моль/мл) вещества.
Расчет IC50 проводится методом пробит-анализа на основе полученных экспериментальных зависимостей Доза ингибитора- ингибирующий эффект
Данный параметр определяется с точностью, соответствующей погрешности пипеток используемых при титровании вирусной суспензии и статистической погрешности, определяемой при подсчете фокусов в монослое клеток.
Метод иммуноферметного анализа
вирус грипп инфицирование клетка флуореiентная детекция
Существуют различные экспериментальные методы исследования взаимодействия антиген-антитело на молекулярном уровне, которые позволяют исследовать структуру и динамику этого взаимодействия.
В настоящее время самым распространенным методом является метод иммуноферментного анализа (ИФА, ELISA). Метод принципиально сходен с РИА, но меткой является молекула фермента, ковалентно связанная с одним из реагентов, а после разделения связанных и свободных реагентов проводится ферментативная реакция, дающая в результате окрашенный продукт, в условиях избытка субстрата. Реакция останавливается (или самотормозится), и количество наработанного продукта измеряется спектрофотометрическим способом. Метод характеризуется высокой чувствительностью.
Наибольшее значение ИФА имеет