Изучение кинетики вирус-клеточного взаимодействия с помощью флуореiентного маркера DND-167 при инфицировании вирусом гриппа культуры клеток MDCK
Дипломная работа - Медицина, физкультура, здравоохранение
Другие дипломы по предмету Медицина, физкультура, здравоохранение
атора фетуина.
На рисунке 17 представлена зависимость доли подавления заражения культуры клеток MDCK вирусом гриппа штамма A/Aichi/2/68 от логарифма дозы ингибитора фетуин.
Рассчитанный IC50 составляет М.
) Применение построенной теоретической модели на кинетическом эксперименте
Расчет теоретической зависимости концентрации вируса на поверхности и внутри клетки в зависимости от времени и начальной концентрации вируса и клеточных рецепторов позволяет получить кинетические параметры системы вирус гриппа A/Aichi/2/68 - рецепторы клеток MDCK, используя зависимость интенсивности флуореiенции от времени методом решения обратной задачи.
Используя данные, полученные методом иммуноферметного анализа, мы подобрали необходимые коэффициенты для корректной аппроксимации зависимости флуореiенции от времени. Расчеты проводились при подстановке в уравнение (3.12) начальной концентрации вируса [V0]= 3,5?10-13M и начальной концентрации свободных клеточных рецепторов [R0]= 3?10-10M.
По полученной аппроксимации сигнала флуореiенции, приведенной на рисунке 18, получена зависимость концентрации вируса участвующего в процессе эндоцитоза от времени.
Также по данным аппроксимации рассчитаны кинетические параметры системы вирус-клетка, находящейся при температуре 370C.
Таблица 2 Кинетические параметры системы вирус- клетка, полученные методом флуореiентной детекции
T, Ck+, (М?min) -1k-,(М?min )-1kin,(М?min)-1371,5?1090,040,3
Приведенные в таблице 2 данные говорят о быстром осаждении вируса на клетку, так как максимальная концентрация вируса достигает [VR]m= 2?10-14М (Рисунок 18), а значит время насыщения клеточных рецепторов вирусом принимает значение tm= 2,60,5мин. (см. Теоретическая часть. Модель процесса эндоцитоза). Это можно объяснить не только самой оптимальной для данного процесса температурой (37С), но и тем фактом, что и вирус и клетки находились в суспензии (в отличие от метода ИФА и ФОЕ, где клетки находились в монослое). Константа проникновения (kin) также достаточно высока, что объясняется быстрой адсорбцией вируса на клетку за счет насыщения системы вирус - клетка клеточными рецепторами.
5.Результаты
В нашей работе была получена степень эффективности ингибитора (противовирусного препарата) методами ФОЕ (стандартный вирусологический метод) и флуореiентной детекции. Обработка результатов ингибирования фокусов и интенсивности флуореiенции системой пробит- анализа позволяет находить необходимый параметр IC50, а также сравнивать различные методики для его нахождения.
На рисунке 19 представлены полученные IC50 для ингибитора фетуин методами ФОЕ и флуореiентной детекции, которые не отличаются на уровне значимости 5%. Данные о степени эффективности ингибитора приведены ниже в таблице 3.
Также при решении обратной задачи метода флуореiентной детекции были получены кинетические параметры системы вирус- клетка, полученные для данного вируса Aichi и клеток линии MDCK методом ИФА. Данные о кинетических константах также приведены ниже в таблице 3.
Таблица 3 Кинетические параметры, полученные различными методами (*[40])
методT0Ck+, М-1?s-1k-, М-1?s-1kin, М-1?s-1tнасыщ, minIC50, МФОЕ37----Флуореi. детекции37(2,50,2)?108(6,60,5)?10-4(50,3)?10-32,60,4ИФА32(10,1)?105(30,4)?10-4 (20,2)?10-4302-ИФА10(3,30,3)?104(10,1)?10-40--(A/PR8/34)+ MDCK*20--2,6?10-4--
Полученные значения, приведенные в таблице 3 хорошо согласуются между собой: при увеличении температуры возрастают k+ и kin (за счет повышения пластичности мембраны клетки (можно сказать ее плавления), что приводит большей гибкости и в конечном итоге к более быстрому (за счет этого с ростом температуры уменьшается tнасыщ) и более крепкому взаимодействию нескольких рецепторов с одним вирионом).
k - остается практически неизменным.
kin возрастает резко: от отсутствия эндоцитоза при 100С до резкого увеличения на порядок при 370С (в сравнении с 320С).
Однако, существенные различия между параметрами, полученными данными методами можно объяснить тем, что во всех методиках, кроме флуореiентной детекции (ФОЕ, ИФА, [40]) использовался клеточный монослой, тогда как в методе флуореiентной детекции для насыщения системы клеточными рецепторами, использовалась клеточная суспензия, что объясняет самую быструю адсорбцию вируса на клетку.
Таблица 4 Сравнительная характеристика методов ФОЕ, ИФА и флуореiентной детекции на основании полученных результатов
методIC50[VR]in(t)[VR]s(t)ktнасыщkd(Vi+ing)kd(Vi+cells)Рабочее времяФОЕ+------~24ч.ИФА--+++++~1,5ч.Фл. детекции+++++++~30м.
В таблице 4 приведена сравнительная характеристика методов, рассматривающихся в данной работе. Разработанный нами метод (флуореiентной детекции) позволяет получить данные о системе в любой момент времени, что является несомненным преимуществом над другими методиками. Методом флуореiентной детекции можно определить параметр эффективности ингибитора IC50, концентрацию вируса не только на поверхности [VR]s(t), но и внутри клетки [VR]in(t), а также интересующие кинетические параметры системы вирус - клетка. Время, затраченное на проведение эксперимента по которому определяются все необходимые параметры флуореiентным методом ~ 30минут, что является наименьшим экспериментальным временем.
6.Заключение
Для исследования вирус- клеточного взаимодействия разработан новый метод флуореiентной детекции, основанный на измерении степени активации