Изучение кинетики вирус-клеточного взаимодействия с помощью флуореiентного маркера DND-167 при инфицировании вирусом гриппа культуры клеток MDCK
Дипломная работа - Медицина, физкультура, здравоохранение
Другие дипломы по предмету Медицина, физкультура, здравоохранение
клетки (изменение внутреклеточного pH) в ходе процессов связывания и проникновения вируса в клетку. Экспериментальные исследования показали, что ингибирование интенсивности флюореiенциии коррелирует с ингибированием инфекционности вируса гриппа, поэтому данный метод позволяет определять степень эффективности вирусного ингибитора (противовирусного препарата), что было подтверждено с помощью общепризнанного метода фокусообразующих единиц (ФОЕ). Используя метод флуореiентной детекции были получены кинетические параметры системы вирус- клетка, которые не только не противоречат ранее известным, но и совпадают в пределах разумных возможных допущений (что подтверждается данными полученными методами иммуноферметного анализа (ИФА), а также литературными данными [40])
Немаловажен и тот факт, что часто при работе с биологическими системами, наименьшее время проведения эксперимента говорит о лучшей точности определяемых параметров. Именно поэтому метод флуореiентной детекции можно рассматривать как один из наиболее современных и точных методов современной биофизики.
Разработана кинетическая модель взаимодействия вируса с клеткой, учитывающая процесс эндоцитоза, которая достаточно хорошо описывает экспериментально наблюдаемый процесс активации лизо-сенсора DND-167 в результате рецептор- обусловленного эндоцитоза. Данная кинетическая модель позволяет решать обратную задачу флуореiентной детекции и находить необходимые кинетические параметры системы, а также прогнозировать поведение штамма вируса на первых этапах процесса эндоцитоза (связывание и проникновение).
Итоги работы:
oРазработан новый метод определения эффективности ингибитора и кинетических параметров системы вирус-клетка с применением флуореiентной детекции
oПостроена теоретическая модель процесса вирус-клеточного взаимодействия
Выводы:
oПолученные IC50 с помощью стандартного вирусологического и нового флуореiентного методов не отличаются на уровне значимости 5%
oТеоретическая модель, описывающая эндоцитоз, применима для расчетов кинетических параметров системы вирус- клетка
oРазработанная методика измерения степени активации методом флуореiентной детекции в различные моменты времени позволяет судить о стадиях процесса эндоцитоза, в которых находится система вирус-клетка.
7.Список литературы
1.Compans R.W., Choppin P.W. Reproduction of myxoviruses. Comprehensive virology, N.Y., p.179-252, 1975.
2.Naim H.Y., Roth M.G. Basis for the selective incorporation of glycoproteins into the influenza virus envelope. Virology, p.4831-4841, 1993.
.Heggeness M.H., Smith P.R., Ulmanen I. Studies of the helical nucleocapsid of influenza virus. Virology, p.466-470, 1982.
.Lamb R.A., Krug R.M. Orthomyxoviridae : the viruses and their replication. In: Fields Virology. Edited by B. N. Fields, D. M. Knipe, P.M. Howley. Philadelphia: Lippincott-Raven, p.1353-1395, 1996.
.Compans R. W., Content J., Duesberg P. H. Structure of the ribonucleoprotein of influenza virus. Virology, p.795 - 800, 1972.
.Wu W.W. H., Weaver L.L., Pante N. Ultrastructural Analysis of the Nuclear Localization Sequences on Influenza A Ribonucleoprotein Complexes. Molecular Biology, p. 910-916, 2007.
.Baudin F., Bach C., Cusack S. et al. Structure of influenza virus RNP: I. Influenza virus nucleoprotein melts secondary structure in panhandle RNA and exposes the bases to the solvent. EMBO, p. 3158-3165, 1994.
.Elleman C.J., Barclay W.S. The M1 matrix protein controls the filamentous phenotype of influenza A virus. Virology, p.144-153, 2004.
.Horimoto T, Kawaoka Y. Influenza: lessons from past pandemics, warnings from current incidents. Natl. Rev. Microbiology, p.591-600, 2005.
.Baigent S.J., McCauley J.W. Influenza type A in humans, mammals and birds: determinants of virus virulence, host-range and interspecies transmission. BioEssays, p.657-671, 2003.
.Matrosovich M.N., Klenk H.-D., Kawaoka Y. Receptor specificity, host range and pathogenicity of influenza viruses. Influenza Virology: Current Topics. Kawaoka Y. (Ed.). Caister Academic Press, Wymondham, England, p.95-137, 2006.
12.С. Лурия, Дж. Дарнелл, Д.Балтимор, Э. Кэмпбелл, Общая вирусология, Мир, 1981.
13.McClintock P. R., Billups L.C., Notkins A.L., Receptors for encephalomyocarditis virus on murine and human cells, Virology, 106, 261 - 227, 1980.
.Korte T., Herrmann A., pH-Dependent binding of the fluorophore bis-ANS to influenza virus reflects the conformational change of hemagglutinin. European Biophysics Journal, p.105-113, 1994.
.S. Patterson, J.S. Oxford. Early interaction between animal viruses and the host cell: relevance to viral vaccines. Vaccine, p.79-90, 1986.
.Blumenthal R., Bali-Puri Anu, Walter A., Covell D., Eidelman Ofer. pH-dependent Fusion of Vesicular Stomatitis Virus with Vero Cells. Biological Chemistry, p.13614-13619, 1986.
.Daniel L. Floyd, Justin R. Ragains, John J. Skehel, Stephen C. Harrison, Antoine M. van Oijen. Single-particle kinetics of influenza virus. PNAS, p.15382-15387, 2008.
18.Плюснина Т.Ю., Лаврова А.И., Ризниченко Г.Ю., Рубин А.Б.. Моделирование неоднородного распределения и колебаний трансмембранного потенциала и pH вблизи внешней стороны мембраны клетки водоросли Chara coralline. Биофизика, с. 492-499, 2005.
19.Matrosovich M.N., Mochalova L.V., V.P.Marinina, N.E.Byramova, N.V.Bovin. Synthetic polymeric sialoside inhibitors of influenza virus receptor-binding activity. FEBS Lett., 209-211, 1990.
20.M.N.Matrosovich, A.S.Gambaryan, A.B.Tuzikov, N.E.Byramova, L.V.Mochalova, A.A.Golbraikh, M.D.Shenderovich, J.Finne, N.V.Bovin. Probing of the receptor-binding sites of the H1 and H3 influenza A and influenza B virus hemagglutinins by synthetic and natural sialosides. Virology, p.111-121, 1993.
21.A.S.Gambaryan, V.E.Piskarev, A.M.Sakharov, A.B.Tuzikov, N.V.Bovin, N.E.Nifantev, M.N.Matrosovich. H1, H3, and B human influenza virus recognition of sialyloligosaccharides. FEBS Lett., p.57-60, 1995.
.Melike Lakadamyali, Michael J. Rust, Xiaowei Zhuang. Endocytosis of influenza viruses. Microbes and infections, p.929-936, 2004.
.Boerries Brandenburg, Lily Y. Lee, Melike Lakadamyali, Michael J. Rust, Xiaowei Zhuang, James M. Hogle. Imaging Poliovirus Entry in Live Cells. PLOS Biology, p.1543-1555, 2007.
.Martin K., Helenius A. Nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins: the viral matrix protein (M1) promotes export and inhibits import. Cell, p.117-130, 1991.
.Whittaker G., Bui M., Helenius A. The role of nuclear import and export in influenza virus infection. Cell Biology, p.67-71 1996.
.Hess S.T., Kumar M., Verma A. Quantitative electron microscopy and fluorescence spectroscopy of the membrane distribution of influenza hemagglutinin. Cell Biology, p.965-976, 2005.
.Ali A., Avalos R.T., Ponimaskin E. Influenza Virus Assembly: Effect of Influenza Virus Glycoproteins on the Membrane Association of M1 Protein. Virology, p.8709-8719, 2000.
.Lohmeyer J., Talens L.T., Klenk H.D. Biosynthesis of the influenza virus envelope in abortive infection. Genetic Virology, p.73-88, 1979.
.Yasuda J., Bucher D.J., Ishihama A. Growth control of influenza A virus by M1 protein: analysis of transfectant viruses carrying chimeric M gene. J.Virology, p.8141-8146, 1994.
.Chen Chen, Xiaowei Zhuang. Epsin 1 is a cargo-specific adaptor for the clathrin-mediated endocytosis of the influenza virus. PNAS, p.11790-11795, 2008.
.Boe