Изучение кинетики вирус-клеточного взаимодействия с помощью флуореiентного маркера DND-167 при инфицировании вирусом гриппа культуры клеток MDCK
Дипломная работа - Медицина, физкультура, здравоохранение
Другие дипломы по предмету Медицина, физкультура, здравоохранение
?ирион может покидать поверхность клетки. Однако некоторые из адсорбировавшихся на клетке вирионов связываются ней более прочными необратимыми связями. Такие связи приводят к резкому понижению pH в месте связывания - еще одному эффекту вирус - клеточного взаимодействия, возникающему в результате конформационных изменений HA [14-17]. Вследствие этого процесса, а также эффекта трансмембранного потенциала [18] в месте связывания вируса с клеточными рецепторами понижается от нейтрального значения (pH~7) до значений порядка 6.
В основе начального связывания самых различных вирусов с клеткой могут лежать принципиально сходные процессы. Напротив, проникновение вирионов в клетку и активация вирусного генома могут происходить у разных вирусов по-разному. Некоторые вирусы присоединяются к клеточным рецепторам настолько быстро, что адсорбция лимитируется лишь диффузией [13].
Предполагается, что для вируса гриппа специфичен один тип рецепторов, производная сиаловых кислот [19-21]. Прочность связывания увеличивается с повышением температуры, что также обуславливается и постепенным захватыванием вируса рецепторами, латеральная подвижность которых в плазматической мембране увеличивается при повышении температуры.
Связавшийся с рецептором вирус гриппа проникает в клетку, образуя клатриновый (эндосомальный) пузырек, который переходит в раннюю эндосому клетки, значение pH в которой ~6. Далее происходит постепенное закисление среды в эндосоме (до значения pH~5,5 - 5), благодаря чему вирус гриппа сливается с ее мембраной и вирусный геном оказывается в цитоплазме клетки в виде отдельных сегментов - частиц рибонуклеопротеина. Эти частицы должны попасть в ядро, где происходит репликация и транскрипция генома вируса гриппа [22]. Адресная доставка вирусного генома обеспечивается наличием на частицах рибонуклеопротеина соответствующих сигнальных последовательностей [6]. В ядре клетки происходит репликация и транскрипция вирусной РНК и формирование дочерних частиц рибонуклеопротеина, которые мигрируют в цитоплазму, а затем - к месту почкования вируса на плазматической мембране [23]. Синтез гемагглютинина и нейраминидазы происходит на полисомах шероховатого ЭПР, остальные белки синтезируются на свободных полисомах [24-26]. Вирусный белок М1 взаимодействует как с цито-плазматическим концом гемагглютинина, так и с его внутримембранной частью [27], и таким образом играет критическую роль в почковании вируса гриппа [28-29]. Фермент нейраминидаза необходим вирусу для выхода из клетки - в его отсутствие НА одного вириона взаимодействует с сиалированными углеводными цепями соседнего вириона или уже инфицированной клетки, в результате связанный вирус не способен к дальнейшему размножению; NA удаляет сиаловую кислоту и тем самым дает вирусу возможность отсоединиться от соседнего вируса или мембраны клетки-хозяина, то есть делает вирус подвижным и способным к новому жизненному циклу.
Современные методы исследования позволяют проследить весь цикл взаимодействия клетки с отдельной вирусной частицей в реальном времени [30-33], однако эти новые данные мало использованы для построения одной общей теории процесса вирус - клеточного взаимодействия, способной прогнозировать влияние различных штаммов вируса гриппа на культуру клеток или живой организм, а также для возможных путей блокирования данного процесса.
Подавление распространения вирусной инфекции вероятнее всего на этапе связывания вируса с клеточными рецепторами [34] по принципу ингибирования НА-опосредованной адгезии вируса гриппа с помощью синтетических аналогов [19], эффективность которых характеризуется параметром IC50. IC50 - доза ингибитора, необходимая для 50% подавления заражения, которую можно проанализировать в культуре клеток. Нахождение данного параметра напрямую связано с получением не только данных об эффективности противовирусного препарата, но и нахождением параметров кинетических уравнений, описывающих процесс эндоцитоза.
В работе [35] проанализировано стационарное состояние адсорбированного вируса, неспособного к проникновению, в зависимости от различных типов связывания - моновалентного, мультивалентного и мультивалентного с насыщением поверхности клетки вирусом. К сожалению, полученные аналитические выражения слишком громоздки для практического применения и включают в себя большое число неизвестных параметров, что также затрудняет их использование.
Следует отметить, что многие экспериментальные данные получены именно в предположении простейшей модели связывания, когда молекулы лиганда и рецептора рассматриваются как свободные и моновалентные. В действительности взаимодействие является мультивалентным. К тому же, в реальной биологической системе взаимодействие вирус-клетка, как правило, происходит в условиях, когда один из реагентов является иммобилизованным на поверхность либо культуральной посуды, либо в тканях организма, что является случаем гетерогенного связывания.
При моделировании мультивалентного связывания наибольшее распространение получило приближение эквивалентных мест связывания (equivalent site approximation), в котором места для связывания лиганда полагаются идентичными и взаимодействующими с различными рецепторами независимо [36]. При этом пренебрегается возможными внутримолекулярными реакциями, которые, например, могут иметь место для мультивалентных рецепторов [37].
При таком подходе мультивалентный лиганда с валентностью n может связаться с п?/p>