Изучение кинетики вирус-клеточного взаимодействия с помощью флуореiентного маркера DND-167 при инфицировании вирусом гриппа культуры клеток MDCK
Дипломная работа - Медицина, физкультура, здравоохранение
Другие дипломы по предмету Медицина, физкультура, здравоохранение
иментального изучения кинетики взаимодействия вируса с живой культурой клеток предварительно были охарактеризованы следующие параметры:
1.оптимальный возраст монослоя клеток, при котором рецепторные свойства клеток меняются незначительно за время проведения кинетического эксперимента (~48 часов [41])
2.оптимальная концентрация клеток и, как следствие, концентрации клеточных рецепторов(R=NтАвr, N - количество клеток в монослое, r - количество рецепторов на поверхности одной клетки) (~106 клеток в лунке)
.концентрация вирусных частиц в суспензии, используемой для эксперимента, (~10-13M, ~27 по ГА (гемаглютинирующая активность))
Данные, полученные методом ФОЕ
Как уже было упомянуто в разделе Материалы и Методы, в основе методики ингибирования фокусообразующих единиц лежит подвление количества фокусов (зараженных вирусом гриппа штамма A/Aichi/2/68 монослоя клеток MDCK) различными концентрациями аналога клеточных рецепторов - блокатора фетуина. Методика пробит - анализа позволила получить необходимый параметр эффективности данного ингибитора на основе полученных экспериментальных зависимостей Доза ингибитора - ингибирующий эффект.
На рисунке 12 представлена зависимость процента подавления заражения культуры клеток MDCK вирусом гриппа штамма A/Aichi/2/68 от логарифма дозы ингибитора фетуин. Рассчитанный IC50 составляет М.
Данные метода иммуноферментного анализа (ИФА) [41]
На рис.13 представлено взаимодействие штаммов вируса гриппа с аналогом клеточного рецептора белком фетуином (при +100 С) как в виде экспериментальных точек, так и теоретическое, представляющее собой прямую линию, проведенную через экспериментальные точки в координатах Скэтчарда, согласно уравнению:
Тангенс угла наклона (рисунок 13) характеризует равновесную константу ассоциации. Т.е. чем больше угол наклона прямой, тем меньше константа ассоциации, соответственно больше константа диссоциации. Из данных, приведенных на рисунке 13, получим константу взаимодействия вируса гриппа штамма A/Aichi/2/68 с аналогом клеточных рецепторов белком фетуин (при +100С):
Kd= (0,640,1)?10-10М.
Далее аналогичным способом рассматриваются кинетики взаимодействия вируса с культурой клеток линии MDCK при +320С и +100С по данным которых мы сможем определить кинетические параметры, необходимые для решения обратной задачи (рисунки 14,15)
Исследуя зависимости, приведенные на рисунках 14 и 15 были получены кинетические параметры, приведенные в таблице 1
Таблица 1 Кинетические параметры, полученные методом ИФА
Т, 0СKd, Mk+, M-1?s-1k-, s-1kin, s-1+10(3,10,3)?10-11(3,30,3)?104(10,1)?10-40+32(80,6)?10-11(10,1)?105(30,4)?10-4 (20,2)?10-4
Данные параметры позволят более адекватно подобрать аппроксимацию для решения обратной задачи флуореiентной детекции, а также позволят оценить степень достоверности результатов полученных методом флуореiентной детекции.
Данные, полученные методом флуореiентной детекции
Для более быстрой оценки IC50 и для более тщательного исследования вирус-клеточного взаимодействия мы предлагаем новый метод - флуореiентной детекции. Суть его заключается в детекции изменений, происходящих на поверхности и внутри клетки во время процесса эндоцитоза (подробнее - Материалы и Методы).
Для этого мы использовали лизо-сенсор DND-167, интенсивность флуореiенции которого резко увеличивается при понижении pH в диапазоне от 6, до 5. Этот же диапазон соответствует изменению pH на поверхности и в эндосоме клетки при проникновении вируса. Таким образом, наблюдая изменение интенсивности флуореiенции окрашенного вируса на поверхности и внутри клетки, мы можем судить о стадии процесса эндоцитоза в текущий момент времени.
На рисунке 16 изображена зависимость интенсивности флуореiенции от времени, прямопропорциональная концентрации вируса, участвующего в процессе эндоцитоза (3.6). На первых 10 минутах взаимодействия вируса с клеточными рецепторами виден пик флуореiенции, что говорит о начале адсорбции вируса на поверхность клеток (в данном случае DND-167 активируется за счет понижения pH в местах связывания вируса с клеткой, происходящего в результате конформационных изменений HA). Далее, интенсивность не спадает до нуля, а выходит на некоторый уровень, что свидетельствует о постепенном проникновении вируса в клетку (здесь начинается активация лизо-сенсора DND-167 за счет снижения pH в эндосоме клетки). Данную интерпритацию подтверждает та же зависимость, но для ингибированного фетуином (концентрация ~3?10-8М) вируса: пик флуореiенции сдвигается в район 16 минут, что говорит о торможении процесса адсорбции за счет введения конкурента; общая интенсивность падает ~ в 5 раз, что говорит о торможении всего процесса эндоцитоза и постепенной остановке проникновения вируса в клетку.
) Нахождение параметра эффективности ингибитора IC50
Исследуя зависимость интенсивности сигнала флуореiенции после 20 минут взаимодействия вируса с клеточной суспензией от концентрации блокатора фетуина, стало очевидно, что чем больше концентрация ингибитора, тем сильнее подавляется сигнал флуореiенции. Таким образом был проведен расчет IC50 методом пробит-анализа на основе полученных экспериментальных зависимостей Доза ингибитора - ингибирующий эффект используя результаты зависимости подавления сигнала флуореiенции от концентрации блок