Изучение кинетики вирус-клеточного взаимодействия с помощью флуореiентного маркера DND-167 при инфицировании вирусом гриппа культуры клеток MDCK
Дипломная работа - Медицина, физкультура, здравоохранение
Другие дипломы по предмету Медицина, физкультура, здравоохранение
?и от времени, параллельно отслеживалось появление флуореiирующих меток в клеточной суспензии на инвертированном микроскопе Olympus CK40. Первые исследования, проведенные на планшете 96-white показали, что помимо флуореiенции, спровоцированной активацией лизо-сенсора DND-167, имеется сильная флуореiенция самого пластика планшета, что вносит большие помехи, создавая неравномерный фон (таким образом в микроскопе наблюдались четкие светящиеся границы лунок микропланшета). Дальнейшие эксперименты проводились на черных 96 - луночных планшетах с прозрачным дном, что дало возможность в разы уменьшить фон окружения. При микроскопическом изучении культуры клеток результат активации лизо-сенсора наблюдали в виде большого количества светящихся точек в клеточной суспензии, которые отсутствовали до активации.
Алгоритм определения параметра IC50=Kd методом флуореiентной детекции
1.Готовятся растворы фетуина (1мг/1мл PBS).
2.Добавляется в 96-луночные круглодонные стерильные планшеты по 100 мкл поддерживающей среды RPMI
.Готовятся серийные двукратные разведения блокатора фетуина, начиная с разведения 1:20 путем переноса 50 мкл пробы в последующую лунку; из лунок последнего ряда удаляется 50 мкл после последнего разведения блокатора.
.Добавляется в лунки по 50 мкл вирусной суспензии, содержащей ~500 ФОЕ вируса; инкубация 30 мин при температуре 35оC
.Добавляется LysoSensorBlueDND-167 к концентрированной клеточной суспензии в соотношении 1/500. Инкубирование при 35 оC в течение 20 минут.
.Разводится окрашенная DND-167 клеточная суспензия поддерживающей средой RPMI (35 оC) в 10 раз, добавляется в планшет по 50 мкл в лунку к суспензиям вирус-фетуин.
.Проводятся измерения во флуориметре Infinite 200 при 37 оC в течение необходимого времени (время исследуемого в данной работе процесса 20-30 минут)
Полученная зависимость интенсивности флуореiенции от времени для различных концентраций блокатора фетуин, позволяет найти параметр эффективности ингибитора IC50 за счет 50% подавления сигнала интенсивности флуореiенции красителя DND-167.
В отличие от биологического метода (Фокусообразующих единиц (ФОЕ)), методика флуореiентной детекции более точно определяет эффективность ингибитора за счет высокой чувствительности прибора. Также, что немаловажно при работе с живыми системами, данный метод позволяет проводить все необходимые манипуляции в течение 25 минут, в отличие от метода ФОЕ, требующего большего времени (порядка 24 часов).
Решение обратной задачи для нахождения кинетических параметров системы вирус-клетка.
Получение зависимости интенсивности флуореiенции от времени при проникновении вируса в клетку дает возможность определять константы скоростей связывания вирусных частиц с клеточными рецепторами (k+ и k_) и проникновения внутрь клетки (kin) данной системы решая обратную задачу с помощью подбора соответствующих параметров в уравнениях, описывающих адсорбцию вируса на клетке:
его проникновение внутрь клетки:
и суммарную концентрацию вируса, участвующего в процессе эндоцитоза:
В нашем случае мы детектируем сигнал, как с поверхности клетки, так и внутри нее. Однако, снаружи и внутри клетки заведомо разные pH, т.е. одно и то же количество частиц DND-167 (а значит и вирусных частиц) снаружи клетки и внутри будут давать разную интенсивность флуореiенции. Таким образом. детектируемый нами сигнал есть сумма интенсивностей внутри (Iin -описывается уравнением концентрации вирусных внутри клетки(3.5)) и на поверхности (Is -описывается уравнением концентрации адсорбировавшихся вирусных частиц(3.4)), с соответствующими коэффициентами
I=a?Is+b?Iin
Таким образом суммарная интенсивность флуореiенции от времени, детектируемая прибором:
Поскольку эти коэффициенты a и b взаимозависимы, то положим a=1.
Границы соотношений коэффициентов a и b определяются из данных, приведенных на рисунках 7 и 10.
Согласно этим данным, соотношение между интенсивностью при pH=6 и интенсивностью при pH=5,5 равно примерно 2,5, т.е.:
Таким образом, полученная зависимость I(t) (3.8) может быть записана в виде:
В итоге, полученная экспериментально интенсивность флуореiенции может быть описана уравнением (3.11) для нахождения необходимых кинетических параметров, а теоретическая зависимость концентрации вируса на поверхности и внутри клетки, изображенная на рисунке 2, приобретает вид:
На данном рисунке 11 детектируемый сигнал - сумма интенсивностей на поверхности и внутри клетки (с соответствующим коэффициентом b=0,4) и есть решение уравнения (3.12).
4.Экспериментальная часть
Одной из основных задач данной дипломной работы является изучение взаимодействия вируса гриппа именно с живой клеткой. Живая система характеризуется своей изменчивостью во времени, она постоянно находиться в движении. Поэтому при проведении экспериментов очень важно следить за более или менее одинаковыми внешними и внутренними условиями эксперимента. Например, очень важно следить за концентрацией вирусных частиц в суспензии: это влияет не только на определение параметров связывания вируса с клеткой, но и на применимость самой модели (должно соблюдаться условие [R]>>[V], см. Теоретическую часть). Главной изменяющейся единицей в этом процессе является клетка, а точнее ее рецепторы.
При проведении экспер