Geum.ru

Минорный белок сыворотки крови связанный с беременностью альфа 2 -гликопротеин: теоретические и практические аспекты 03. 00. 04. Биохимия

Вид материалаАвтореферат диссертации

Содержание


Поиск аналогов белков у животных
Клеточная локализация СБАГ.
Белковые препараты
Подобный материал:
1   2   3   4   5   6


За весь период работы целенаправленно или в качестве контроля изучено более 3000 образцов крови здоровых лиц разных возрастов, в том числе 243 детей, 269 студентов и 643 доноров. Частота выявления этого белка колебалась в разных группах у здоровых мужчин от 18 до 30%, а у женщин от 20 до 45%.

Частота выявления СБАГ выше не только у женщин в 1,5-2 раза, чем у мужчин, но и у девочек по сравнению с мальчиками.

С

амая высокая частота обнаружения СБАГ отмечена у лиц с I группой крови (рис 5).


Рис 5. Частота выявления СБАГ в сыворотке крови доноров

в зависимости от групп крови


^ Поиск аналогов белков у животных, как правило, преследует цель определить эволюционные изменения первичной структуры белков, находящих отражение в соответствующих изменениях их антигенной специфичности. ИДА является незаменимым в этих целях по сравнению с другими иммунохимическими методами, особенно подходят оранжировки анализа в штампах «четверка» и «семерка».

В таблице 8 приведены полученные результаты иммунохимической идентификации СБАГ параллельно с другими индивидуальными белками человека у обезьян Macaca: Rhesus, Cynomolgus, Fascicularis. В качестве объектов были выбраны белки, имеющие разное происхождение: материнское, плодовое и плацентарное.


Таблица 8

Идентификация аналогов СБАГ и других белков, синтез которых усиливается при беременности, в крови обезьян Старого Света

Белки человека
Наличие аналога у обезьян

Характеристика идентичности

Полная
Неполная с числом общих детерминант

высоким
низким

Сывороточные: СБАГ
+
+






МГ
+
+






Плацентарные: ТБГ
+






+

ПЛЧ
+






+

Плодовые: АФП
+



+




Установлено, что полной идентичностью обладают СБАГ (рис 6) и МГ, неполной – АФП, очень низкой – ТБГ, ПЛЧ.




А – антисыворотка на СБАГ

1 - пул сыворотки крови беременных женщин;

2 - пул сыворотки крови беременных обезьян


Рис. 6. Идентификация СБАГ в сыворотке крови беременных обезьян


СБАГ был выявлен во всех исследуемых образцах крови беременных обезьян и в 70% случаев небеременных самок (табл 9).

Таблица 9

Количественное определение СБАГ в сыворотке крови обезьян

Сыворотка крови обезьян
Число образцов
Концентрация СБАГ (мг/л)

Min - max
Mm
P

небеременных
9
10 - 20
15,551,66



беременных
6
20 -0
64,013,94
0,001

кормящих
3
5 - 10
8,33 1,98



Всего:
18
5 - 80





Высокие значения частоты выявления и концентрации (5-20 мг/л) СБАГ у небеременных особей могут служить основой для обсуждения эволюционных изменений иммунореактивности организма, так как у человека этот белок в концентрации >10 мг/л присутствует только при беременности, воспалении, опухолях. Установленный факт можно предположительно объяснить с разных позиций: во-первых, не исключено, что он является филогенетически древним (распространенным) и его основная функция активнее востребована у животных, стоящих на более низких ступенях эволюционной лестницы, а у человека заменена другими структурами и этот белок становится дополнительным звеном защиты; во-вторых, более прозаическая причина может заключаться в том, что практически все обезьяны имеют хронические воспалительные заболевания, которые и вызывают усиленную продукцию СБАГ.


Полученные результаты позволяют предположить, что структурные гены СБАГ и МГ являются наиболее стабильными в течение эволюционного времени, а с позиций филогенетической дивергенции самыми молодыми из изученных белков являются ТБГ и ПЛЧ, обладающие слабо выраженной неполной антигенной идентичностью с их аналогами у обезьян.

^ Клеточная локализация СБАГ. Наиболее убедительными являются литературные данные о том, что местом синтеза сывороточного СБАГ являются плазматические клетки. Отсутствие его в других биологических жидкостях логично объясняется большой молекулярной массой. Выявление СБАГ в маточных смывах при патологии эндометрия побудило к проведению сравнительного иммуногистохимического изучения СБАГ в 43 образцах дефинитивных и патологически измененных тканей эндометрия в сопоставлении с тканью плаценты, толстого кишечника, аппендикса и печени.

Методом непрямого иммунофлюоресцентного анализа выявлено, что СБАГ содержится в тканях нормального (рис 7) и патологически измененного эндометрия (гиперплазия, дифференцированный рак). Интенсивность свечения колебалась в различных образцах от умеренной до высокой. Флюоресценцию наблюдали в апикальных отделах железистого эпителия и в крупных клетках стромы, расположенных ближе к базальному отделу железистого эндометрия, а также в просветах железистых образований. При атипичной гиперплазии СБАГ выявляли в 100% случаев, при умеренно дифференцированном раке лишь в 56,5%. При железистой гиперплазии СБАГ не был выявлен.

При изучении плаценты отмечена интенсивная флюоресценция в клетках крови матери - сегментоядерных лейкоцитах и лимфоцитах (рис. 8), что позволяет предположить функционально обусловленную (за счет соответствующих рецепторов) локализацию на этих клетках белков беременности (аналогичная картина была и для ТБГ) или их синтез клетками крови.











Рис 8. Локализация СБАГ в клетках крови:

сегментоядерных лейкоцитах и средних лимфоцитах




Рис 7. Выявление СБАГ

в тканях пролифирирующего

эндометрия


Установлено, что в тканях толстого кишечника и эндометрия концентрация СБАГ существенно возрастает при малигнизации (рис 9, 10). Влияние аденокарциноматоза на содержание СБАГ в органе и, соответственно, на его синтез проявляется в зависимости от органа в различной степени. Так, максимальное увеличение концентрации СБАГ более чем в 4 раза отметили в малигнизированном кишечнике. Увеличение содержания СБАГ в малигнизированном эндометрии выражено меньше.


а) б)

Рис 9. Иммунофлюоресцентный анализ СБАГ в нормальном (а) и

малигнизированном эндометрии (б)


Полученные результаты о достоверном увеличении уровня СБАГ при злокачественных опухолях подтверждают ранее высказанные предположения о возможности включения его в группу неспецифических сывороточных маркеров рака.


а) б)

Рис 10. Иммунофлюоресцентный анализа СБАГ в нормальном (а) и

малигнизированном (б) толстом кишечнике


Вероятно, при канцерогенезе в клетке увеличивается содержание факторов, играющих роль индукторов дерепрессии структурного гена СБАГ.


Вслед за выявлением корреляции между уровнем СБАГ и иммуноглобулинов классов A и G нами было проведено изучение иммуномодулирующего действия белковых препаратов СБАГ и ТБГ in vivo. На первом этапе мы не стремились полностью очистить исследуемые белки от основных белковых компонентов сыворотки крови для максимального сохранения нативных свойств исследуемых белков, включая заряд, конформацию и межмолекулярные взаимодействия, и вводили мышам полуочищенные препараты СБАГ и ТБГ после препаративного электрофореза в агаре и диализа. Были получены предварительные результаты по иммуносупрессивному действию обоих белков, более выраженному у ТБГ.

На втором этапе исследования использовали высокоочищенные препараты белков беременности и двух сывороточных белков в качестве объекта сравнения (табл 10, 11). При расчете дозы препарата исходили из удельной физиологической концентрации исследуемых белков.

Таблица 10

Сравнительное определение влияния белковых препаратов на количество

антителообразующих клеток в селезенках мышей при первичном

иммунном ответе

Белковые

препараты

0,1% - 0,5 мл

n
Доза

мг/кг
АОК,

Mm
% от

контроля
Степень

достовер

ности

ТБГ 1 мг/мл
15
25
273953850,3
40,79
р<0,001

СБАГ 1 мг/мл
21
25
594292552,8
88,49
p<0,05

2-МГ 1 мг/мл
16
25
628603241,2
93,60
p>0,05

АФП 0,5 мг/мл
15
12,5
700003228,8
104,24
p>0,05

АФП 1 мг/мл
14
25
866434005,0
129,01
p<0,02

АФП 3 мг/мл
17
75
1637144851,2
243,78
p<0,001

Контроль
37


671552904,8
100,0



Полученные данные полностью подтверждают сложившееся представление об иммуносупрессивном влиянии ТБГ и СБАГ на систему иммунитета, а также о дозазависимом иммуностимулирующем эффекте АФП.

Число АОК в селезенках опытных мышей на пике иммунного ответа составило от аналогичных показателей в контрольной группе животных в 2 раза большее для ТБГ, чем для СБАГ, значение, то есть, ТБГ отличается более выраженным эффект иммуносупрессии. Такое распределение иммунотропного влияния, очевидно, имеет глубокий биологический смысл, так как ТБГ, эволюционно более молодой, является специфическим белком беременности, синтезируемым синцитиотрофобластом, а СБАГ - сывороточным минорным компонентом, реагирующим не только на беременность, но и на воспаление.

Таблица 11

Сравнительное определение влияния белковых препаратов на массу селезенки мышей при первичном иммунном ответе на ЭБ

^ Белковые препараты
Доза

мг/кг
Число

n
Масса

селезенки,

мг, Mm
% от

контроля
Степень

достоверности

СБАГ
25
21
1503,1
86,75
р<0,001

ТБГ
25
15
1584,6
91,33
p<0,05

2-МГ
25
16
174,35,2
100,8
p>0,05

АФП 0,25мг
12,5
15
252,83,7
146,21
р<0,001

АФП 0,5 мг
25
14
314,65,1
181,95
р<0,001

АФП 1,5 мг
75
17
372,49,3
215,38
р<0,001

Контроль


37
172,94,4
100,0



Возможно, что СБАГ является полифункциональным белком и оказывает опосредованное регулирующее воздействие на иммунные реакции.

Изучение тропности СБАГ к половым гормонам (эстрадиолу, эстриолу, тестостерону) методом аффинной хроматографии показало максимально выраженное сродство к эстрадиолу и минимальное – к мужскому половому гормону.

При анализе более 1000 случаев была отмечена закономерность в динамике продукции материнского (СБАГ) и плацентарного (ТБГ) белков на протяжении всей беременности (рис 11). При физиологически протекающей беременности уровень материнского белка, как правило, выше плацентарного только в начале беременности. Во второй половине беременности ТБГ «обгоняет» СБАГ, то есть плацента за счет увеличения объема берет на себя большую часть функции поддержания иммунотолерантности в системе мать-плод-плацента. Следовательно, иммуносупрессивная активность указанных белков в норме сбалансирована и имеет важное значение для благоприятного течения беременности и благополучного исхода родов. По всей вероятности, огромное значение в препятствии отторжению фетоплацентарного комплекса организмом матери играет суммарный иммуносупрессивный эффект белков беременности.




Рис 11. Динамика концентрации белков беременности материнского, плацентарного и плодового происхождения


В практических целях для оценки течения беременности был проведен математический расчет отношения материнского белка к плацентарному. Этот показатель назван коэффициентом иммунологической адаптации (КИА). Выход коэффициента за пределы физиологического диапазона может свидетельствовать о наличии осложнений беременности.

Контрольное обследование 446 женщин с патологически протекающей беременностью показало достоверное изменение КИА при поздних гестозах, плацентарной недостаточности, внутриутробном инфицировании плода и пролонгированной беременности (табл 12). В зависимости от тяжести гестоза КИА заметно повышается за счет снижения концентрации ТБГ (деструктивные изменения в плаценте) и повышения уровня СБАГ. При перенашивании плода изменяется динамика обоих белков, их уровень снижается, но быстрее падает уровень ТБГ. Таким образом, выход коэффициента за пределы физиологического диапазона может свидетельствовать о наличии осложнений беременности.

Таблица 12

Характеристика материала клинических испытаний

Характер патологии

беременности
n
СБАГ

ТБГ
КИА

Поздние гестозы
103
N-38 (36,9%)

>N-51 (49,5%)
N-31 (30,1%)

>N-24 (23,3%)
N-35 (34,0%)

>N-47 (45,6%)

Фетоплацентарная недостаточность
27
N-15 (55,6%)

>N- 2 (7,4%)
N-11 (40,7%)

>N-11 (40,7%)
N- 3 (11,1%)

>N- 7 (25,9%)

Внутриутробное инфицирование плода
79
N-23 (29,1%)

>N-42 (53,2%)
N-38 (48,1%)

>N-32 (40,5%)
N- 3 (3,8%)

>N-13 (16,7%)

Эндоцервикоз
14
N- 5 (35,7%)

>N- 8 (57,1%)
N- 2 (14,3%)

>N-10 (71,4%)
N- 0

>N- 3 (24,4%)

Угроза отслойки

плаценты
41
N- 18 (43,9%)

>N-15 (36,6%)
N-6 (14,6%)

>N-32 (78,0%)
N- 0

>N- 5 (12,2%)

Переношенная беременность
75
N- 1 (1,3%)

>N- 0
N-35 (46,7%)

>N- 0
N-35 (46,7%)

>N-13 (17,3%)


Результаты исследований, подтвержденные другими авторами, показали, что продукция СБАГ возрастает при целом ряде патологических состоянии, не связанных с беременностью: воспалении, опухолях, системных заболеваниях, как у взрослых, так и у детей. Его максимальные концентрации были отмечены при активном ревматизме, при туберкулезном бронхоадените, при гломерулонефрите, инфекционно-аллергическом миокардите (табл 13).

На основании выявления этого белка при воспалительном процессе различной нозологии можно считать СБАГ неспецифическим маркером воспаления. При определении СБАГ параллельно с другими БОФ была выявлена иная, чем, например у СРБ, динамика его синтеза в течение развития и разрешения воспалительного процесса. Он выявляется на всем протяжении воспаления, что позволяет отнести СБАГ к индикаторам и латентных форм воспаления. При динамическом наблюдении снижение уровня СБАГ всегда совпадало с улучшением самочувствия и функциональных показателей.

Таблица 13


Определение СБАГ в сыворотке крови больных воспалительными

и невоспалительными заболеваниями в концентрации


Заболевания
n
Выявление СБАГ при концентрации < 5 мг/л


Выявление С Б А Г

Частота
М±m
Диапазон

С е р д ц а

Ревмокардит I
105
0.85
9.88
5 - 20

Ревмокардит II-III
73
0.98
17.50
10 - 80

Инфаркт миокарда
103
0.52
9.14
5 - 20

Кардиопатия
40
0.15
5.83
5 - 10

инфекционно-аллер-гический миокардит

54

0,76

20,98

5 - 80

Ревматоидный полиартрит


63

0,68

17,36

5-40

Л е г к и х

Острая пневмония
83
0.71
15.84
5 - 40

Хронический бронхит
133
0.67
12.69
5 - 40

Бронхиальная астма
124
0.68
16.19
5 - 40

Т у б е р к у л е з

-вираж туберк. проб
84
0.65
18.28
5 - 40

-бронхоаденит
118
0.73
20.34
5 - 80

-инфильтрат. форма
72
0.73
22.29
10 - 80

-диссеминир. форма
45
0.80
19.86
5 - 80

-фиброзно-каверноз.
32
0.84
24.07
10 -120

Пневмокониозы

49
0.67
10.45
5 - 20

П о ч е к

Гломерулонефрит
20
0.75
14.33
5 - 80

Пиелонефрит

51
0.66
13.52
5 - 40

К и ш е ч н и к а












Хронический колит:

-язвенный

36

0,58

12,14

5-40

- постдизентерийный
43
0,60
9,80
5-20

- эндогенный
33
0,36
7,91
5-20

Всего

1256











Тест на СБАГ предпочтительнее других лабораторных показателей для оценки эффективности лечения и диспансерного наблюдения за больными. Сравнение теста на СБАГ с традиционными лабораторными показателями воспаления выявило его преимущество в оценке эффективности лечения и диспансерном наблюдении при различных формах заболеваний с выраженным аутоиммунным компонентом.

В таблице 16 приведена часть результатов изучения клинической значимости иммунохимического теста на СБАГ в онкологической практике.

Таблица 14

Выявление СБАГ в сыворотке крови больных в зависимости от вида и локализации опухолей

Локализация
Количество образцов

всего / позитивных
Частота

выявления, %
Концентрация,

мг/л

общее
муж
жен

Злокачественные опухоли:

Тела матки




-

46/41
89,13
82,67±9,4

Шейки матки






10/ 9
90
37,77±6,13

Яичников







24/22
91,25
21,78±3,51

Молочной железы






43/39
90,7
32,52±5,23

Простаты



39/33



84,61
23,24±3,27

Бронхолегочной системы

48/48

22/22

16/16

100

55,34±8,13

Пищевода и

желудка
5/5
3/3
2/ 2
100
17,52±2,48

Прочие
17/15
5/4
12/11
88,23
29,83±3,84

Доброкачественные опухоли:

Матки







39/34
87,20
19,61±2,38

Простаты



48/31



64,58
7,65±0,85

Прочие
12/10
4/3
8/7

83,33
15,27±0,30