Geum.ru

Программа фундаментальных исследований Президиума ран

Вид материалаПрограмма

Содержание


Выяснение РОЛИ Амилоидных САРКОМЕРНЫХ ЦИТОСКЕЛЕТНЫХ БЕЛКОВ в РАННЕЙ ДИАГНОСТИКе амилоидозов и их коррекции
Ю.В. Шумилина
Mptp модель ранних форм паркинсонизма на мышах линии c57bl/6: анализ межклеточной концентрации дофамина и его метаболитов в стри
А.С. Базян, Р.Г. Аверкин, В.А. Коршунов, Н.В. Щеголевский, А.А. Фоломкина, Г.А. Григорьян
Подобный материал:
1   2   3   4   5   6   7   8   9   ...   72
^

Выяснение РОЛИ Амилоидных САРКОМЕРНЫХ ЦИТОСКЕЛЕТНЫХ БЕЛКОВ в РАННЕЙ ДИАГНОСТИКе амилоидозов и их коррекции




З.А. Подлубная1), Л.Г. Марсагишвили1), М.Д. Шпагина1), И.М. Вихлянцев1),

^

Ю.В. Шумилина1),

А.А. Федюшин2), Т.В. Гордиенко2), И.М. Ильинский3), Р.У. Островская4), А.Б. Гехт5)

1)Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино; 2)Больница Пущинского Научного Центра РАН, Пущино; 3)ФГУ «НИИ трансплантологии и искусственных органов» Росздрава, Москва; 4)Институт фармакологии РАМН, Москва; 5)Российский Государственный медицинский университет, Москва


Амилоидозы характеризуются неограниченно растущими белковыми отложениями в виде нерастворимых фибрилл (амилоидов) в разных органах и тканях, образующихся в результате наследственного или приобретенного нарушения сворачивания белков. Их накопление нарушает структуру и функцию органов и тканей, приводя к летальному исходу. Амилоиды играют центральную роль в патогенезе болезней, от которых страдают миллионы пациентов (болезнь Альцгеймера - БА, Паркинсона, второй тип диабета, синдром Дауна, прионные болезни и др.). Эти болезни - главная причина смерти после сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний. Молекулярные механизмы амилоидозов до конца неясны. Их выяснение необходимо для предупреждения амилоидозов, их ранней диагностики и назначения своевременного, эффективного лечения. Для этого необходимо знание амилоидогенеза: выявление общих свойств амилоидов, образуемых разными белками, знание факторов, регулирующих их образование и разрушение, их эффектов на жизнедеятельность клеток. В рамках программы Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине» мы открыли новые амилоидные белки, саркомерные мышечные белки семейства тайтина (тайтин, С-, Х-, и Н-белки). Присутствие аутоантител к Н-белку и Аβ-пептиду в сыворотке крови у пациентов, биопсии которых предполагали амилоидоз, было выявлено твердофазным иммуноферментным анализом (ТИФА). Это открывает пути развития ранней щадящей диагностики амилоидозов. С помощью ЭМ показано сходство амилоидных агрегатов этих белков с амилоидами Аβ-пептида в мозге при БА и возможность сходных подходов к их разрушению. Показано, что тетрациклин и фуллерены С60 разрушают как амилоиды Аβ-пептидов, так и амилоиды Х-, С- и Н-белков, подобно действию тетрациклина на амилоиды других белков (хантингтина, тау белка, амилина и прионного белка). Ноопепт, пептид также разрушает амилоиды Аβ-пептидов. Более того, тетрациклин и фуллерены С60 не только разрушают зрелые амилоиды, но и ингибируют рост новых амилоидных структур, что важно в терапии амилоидозов. На культуре полиморфноядерных лейкоцитов (ПМЯЛ) показано, что токсичность амилоидов, приводящая к гибели клеток, снижается в присутствии тетрациклина и фуллеренов, разрушающих амилоиды, приводя к увеличению выживаемости ПМЯЛ, что свидетельствует о нетоксичности самих препаратов и образуемых ими фрагментов амилоидов. Цель будущих исследований -- разработка терапевтических подходов к предотвращению или замедлению амилоидогенеза in vivo по оценке клеточной токсичности амилоидов белков в разных клеточных культурах и на разных стадиях амилоидогенеза in vitro, что позволит проводить скрининг препаратов, разрушающих зрелые амилоидные фибриллы и предотвращающих образование новых фибрилл по снижению токсичности в их присутствии. Первые обнадеживающие результаты уже получены. Комплексные методические подходы, с одной стороны, дающие визуальную оценку антиамилоидогенных свойств разных препаратов, а с другой, оценивающие их способность повышать выживаемость клеток, позволяют осуществлять подбор наиболее ценных лекарственных средств для борьбы с разными амилоидами и амилоидозами. Несомненно, что большое значение в терапии имеет также и ранняя диагностика разных амилоидозов, например, регистрация с помощью ТИФА в крови пациента аутоантител к амилоидам или амилоидных белков с помощью антител и снижения их количества в крови как указание на эффективность используемого терапевтического подхода.


^

MPTP МОДЕЛЬ РАННИХ ФОРМ ПАРКИНСОНИЗМА НА МЫШАХ ЛИНИИ C57BL/6: АНАЛИЗ МЕЖКЛЕТОЧНОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ ДОФАМИНА И ЕГО МЕТАБОЛИТОВ В СТРИАТУМЕ МЫШЕЙ МЕТОДОМ МИКРОДИАЛИЗА.



^

А.С. Базян, Р.Г. Аверкин, В.А. Коршунов, Н.В. Щеголевский, А.А. Фоломкина,

Г.А. Григорьян

Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, Москва



Одним из наиболее актуальных направлений в современных исследованиях болезни Паркинсона является поиск специфических показателей (маркеров), изменения которых улавливают самые ранние проявления заболевания. Понятно, что такими маркерами могут быть самые разнообразные показатели жизнедеятельности организма – от тонких молекулярно-генетических изменений нейрона до изменения его нейрохимических и электрофизиологических характеристик, и далее до общеструктурных морфо-гистологических, лабораторно-клинических и прочих проявлений.

Для выявления специфических маркеров необходимо разработать модель болезни Паркинсона на животных позволяющей исследовать разные стадии развития этого заболевания. Целью данной работы было разработать модель ранних форм паркинсонизма на мышах линии C57BL/6, разработать метод in vivo определения межклеточной концентрации ДА и его метаболитов (ДОФУК и ГВК) в стриатуме мышей с помощью сочетания микродиализа с высокоэффктивной жидкостной хроматографией и исследовать корреляцию между нарушением поведения мышей вызванной инъекцией MPTP и межклеточной концентрацией ДА и его метаболитов.

Опыты проводили на 23 самцах 3х месячных мышей C57BL/6 массой 28 – 32 г. Опытным мышам (n = 14) однократно внутрибрюшинно вводили MPTP в дозе 20 мг/кг в объеме 30 мкл физиологического раствора. Контрольным мышам (n = 9) внутрибрюшинно вводили 30 мкл физиологического раствора. Поведение мышей и межклеточную концентрацию ДА и его метаболитов в стриатуме исследовали in vivo сразу, через 7 и 30 суток после введения MPTP. В первой серии экспериментов, сразу после введения MPTP; у интактных животных методом микродиализа определяли межклеточную концентрацию ДА и его метаболитов, затем вводили MPTP и проводили дальнейшее определение концентраций. В двух других сериях через 7 и 30 суток опыты проводились на двух животных, в один и тот же день. Всем мышам и контрольным и опытным под наркозом вставляли направляющую для ввода микродиализной канюли. Микродиализную канюлю вводили бодрствующим мышам непосредственно перед определением межклеточной концентрации ДА, ДОФУК и ГВК. Микродиализат начинали собирать через 40 мин после введения канюли с интервалом каждые 20 мин. Скорость потока 1 мкл/мин. Было показано, что острое введение MPTP вызывает нарушения поведения у мышей, резкое уменьшение жвигательной активности, которое сопровождается уменьшением межклеточной концентрации ДА и ГВК в стриатуме. Концентрация ДОФУК не меняется. Через неделю после введения MPTP двигательная активность мышей нормализуется и вместе с этим нормализуется межклеточной концентрации ДА, ДОФУК и ГВК в стриатуме. Через 30 суток поведение мышей опять нарушается. У одних животных наблюдаются миоклонизмы, которые обычно приписываются к нарушениям ДА системы. У других животных резко уменьшается двигательная активность. Исследование микродиализата выявило достоверное уменьшение межклеточной концентрации ДА в стриатуме, без изменения концентраций ДОФУК и ГВК. Таким образом, нарушение поведения у мышей линии C57BL/6 вызванное введением MPTP и in vivo исследование межклеточной концентрации ДА и его метаболитов в стриатуме методом микродиализа являются адекватными моделями для исследования болезни Паркинсона в различных ее стадиях.