Комплекс методов общего анализа мочи включает: макроскопическую оценку с описанием общих физических свойств
| Вид материала | Исследование |
- Использование электромагнитной терапии (лечебное кресло neocontrоl) в лечении недержания, 169.2kb.
- Программа курса «электрохимические методы анализа», 20.91kb.
- 2 Ломоносов И. М, 1366.96kb.
- Рекомендовано Минобразованием России для направлений подготовки: бакалавров 550500, 55.54kb.
- Вопросы к экзамену по аналитической химии для студентов химического отделения физико-химического, 46.33kb.
- Широкое применение получил анализ, предполагающий комплексную оценку внешнеэкономической, 94.4kb.
- Программа, контрольные вопросы и упражнения по неорганической химии под редакцией проф.,, 600.91kb.
- Правила обработки и анализа результатов эксперимента с использованием методов математической, 47.52kb.
- Рабочая программа «Практикум по алгебре» в 10 а классе, 70.39kb.
- Конспект для проведения экспертизы групп и организаций на предмет их принадлежности, 150.63kb.
ПРИЛОЖЕНИЕ В
(рекомендуемое)
Подтверждение результатов, полученных с помощью тест - полосок, другими методами: определение относительной плотности урометром, белка, глюкозы, билирубина и уробилиногена - химическими методами
В.1 Измерение относительной плотности мочи с помощью урометра.
Измерение относительной плотности урометром считается референтным методом и используется при получении низких или высоких значений плотности при определении тест-полосками.
Относительная плотность есть отношение массы образца мочи к массе равного объема дистиллированной воды при той же температуре. Отношение выражается числовыми значениями; нормальные значения: 1.003 – 1.035. Относительная плотность мочи зависит от концентрации растворенных в ней веществ (мочевины, солей натрия, белка, глюкозы и др.).
П р и м е ч а н и е ─ При измерении тест-полосками неионизированные вещества (глюкоза, рентгено-контрастные вещества) не влияют на результаты, тат как принцип измерения основан на зависимости относительной плотности от ионной концентрации.
Для определения относительной плотности используют урометры (комбинированные ареометры) с диапазоном шкалы от 0.001 до 1.050. При использовании урометра необходимо, чтобы он плавал в контейнере (цилиндре) и при этом не касался стенок, что требует достаточно широкого контейнера и относительно большого количества мочи. На определение относительной плотности урометром влияет температура, при которой производится измерение. Урометры градуированы для измерения при строго определенной температуре (15°, 20°, 22°С), обозначенной на приборе. Любое отклонение от этой температуры приводит к изменению объема и, следовательно, концентрации растворенных веществ и относительной плотности. При температуре, выше указанной, объем мочи увеличивается, концентрация и относительная плотность снижается, падение температуры приводит к обратному эффекту. При перемене температуры на три градуса относительная плотность изменяется на 0,001. Присутствие белка и глюкозы повышает относительную плотность: каждые 3 г/л белка дает повышение на 0.001, каждые 10 г/л глюкозы – на 0.004.
В.2 Измерение концентрации белка в моче химическими методами.
Измерение концентрации белка в моче химическими методами проводится в надосадочной жидкости (супернатанте) после центрифугирования мочи в стандартном режиме (1500 об/мин 10 мин).
В.2.1.Референтным методом измерения концентрации белка в моче является биуретовый метод, который выявляет полипептидные связи и не зависит от аминокислотного состава белка. Он с одинаковой эффективностью определяет альбумины, глобулины и другие белки. В связи с низкой чувствительностью метода определение белка в моче требует проведения осаждения и концентрирования белка, поэтому из-за большой трудоемкости метод в лаборатории практически не используется. В качестве химических методов рекомендуется исследование белка в моче с сульфосалициловой кислотой (ССК) и пирогаллоловым красным (ПГК).
В.2.2. Измерение концентрации белка в моче с сульфосалициловой кислотой.
Принцип метода: при взаимодействии белка мочи с ССК происходит денатурация белка и образование преципитатов, которое приводит к помутнению раствора. Степень помутнения условно пропорциональна содержанию белка в растворе.
Обнаружение белка с ССК (качественная проба).
Реактивы: 20% раствор сульфосалициловой кислоты.
Ход определения: в 2 пробирки (опытная и холостая пробы) наливают около 3-х мл супернатанта мочи. К опытной пробе добавляют 6-8 капель реактива. На темном фоне сравнивают опытную и холостую пробы. Помутнение в опытной пробе указывает на наличие белка, проба считается положительной.
П р и м е ч а н и е 1 ─ При щелочной реакции порцию мочи для исследования подкисляют 2-3 каплями слабой уксусной кислоты.
Количественное определение белка с ССК.
Реактивы: 3% раствор ССК, 0,9% раствор хлорида натрия (физиологический раствор), 1% раствор калибровочного раствора белка.
Оборудование: фотометр, автоматические пипетки, пробирки.
Ход определения: к 1 мл мочи добавляют 3 мл 3% ССК, перемешивают и инкубируют 10 мин. Время инкубации отмечают по первой пробе. В качестве холостой пробы используется проба мочи с физиологическим раствором. Холостая проба ставится отдельно для каждого пациента. По окончании срока инкубации измеряют абсорбцию опытной пробы против холостой при длине волны 590-650 нм. Определение концентрации проводят по калибровочному графику или по таблице, составленной в соответствии с графиком.
Калибровочный график. Для построения графика готовят разведения 1% калибровочного раствора белка физиологическим раствором до конечной концентрации 0,05; 0,1; 0,2; 0,5 и 1 г/л.
Каждое из разведений анализируют аналогично пробе мочи. По результатам анализа строят калибровочный график в координатах: абсорбция (ось ординат), концентрация (ось абсцисс). Линейность метода сохраняется до 1 г/л. При концентрациях белка выше предела линейности пробу мочи разводят физиологическим раствором в 5-10 раз и результат измерения умножают на разведение.
Референтные пределы: 0,01-0,140 г/л, 0,05 – 0,08 г/сут. (по Н.У. Тицу, 1997).
П р и м е ч а н и е 2 ─ В качестве калибровочного образца может быть использован альбумин и белок, состоящий из смеси альбумина и глобулина. Использование смешанного белка в качестве стандарта повышает надежность результатов. Выпускаются готовые наборы калибровочных образцов белка для построения калибровочного графика.
П р и м е ч а н и е 3 ─ В России производятся готовые наборы реактивов для определения концентрации белка с ССК.
Источники ошибок. Ложноположительные результаты могут быть получены при наличии в моче йод-контрастных веществ, большого количества пенициллина и сульфаниламидов, высокой концентрации мочевой кислоты. К недостаткам метода относится низкая устойчивость преципитата, сложная нелинейная зависимость абсорбции от концентрации белка, существенные различия в белковом составе калибратора и пробы мочи, неполная преципитация ряда белков анализируемой пробы, что приводит к получению заниженных результатов. Проба с ССК привлекательна исключительно по своей простоте и низкой себестоимости.
В.2.3 Количественное определение белка с пирогаллоловым красным
(ПГК)
Принцип метода: при связывании белка с органическим красителем пирогаллоловым красным в кислой среде образуется окрашенный комплекс, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию белка в пробе. Комплекс устойчив к воздействию многих соединений, в том числе лекарственных препаратов, солей, оснований, кислот.
Реактивы. Для определения белка используют готовые наборы реактивов, которые выпускаются различными производителями. калибровочный раствор белка входит в состав набора.
Оборудование: фотометр, автоматические пипетки.
Ход определения указан в методике анализа. Измерение абсорбции проводится при длине волны 600 нм. Абсорбция остается стабильной при температуре измерения от 25 до 370С как минимум в течение 30 мин после окончания химической реакции. Линейность метода достигает 4-х г/л белка, а чувствительность составляет 0,03-0,04 г/л. Метод отличает хорошая воспроизводимость результатов, простота и удобство исполнения.
П р и м е ч а н и е 4 ─ Краситель ПГК не сорбируется на стенках кювет до концентрации белка 5 г/л, поэтому метод используется для измерения концентрации белка на автоматических биохимических анализаторах.
Специфичность. Метод наиболее чувствителен к альбумину, однако его чувствительность к глобулину и миеломному белку находится в пределах 70% по сравнению с альбумином. Использование в качестве калибровочного образца смешанного белка снижает возможную погрешность в определении.
Источники ошибок. Возможные источники ошибок и влияющие факторы указаны в методике анализа. Вещества, присутствующие в моче, дают суммарную ошибку определения около 2%.
В.3 Определение глюкозы химическими методами
Для определения глюкозы используют глюкозооксидазный или гексокиназный методы.
Принцип глюкозооксидазного метода: метод основан на окислении глюкозы глюкозооксидазой с образованием перекиси водорода, которая под действием пероксидазы окисляет ортотолидин или другое вещество, например, фенолфталеин, с образованием окраски, интенсивность которой измеряется фотометрически.
Имеются готовые наборы реактивов для выполнения гдюкозооксидазного метода, необходимо тщательно изучать инструкцию и точно ей следовать.
Концентрацию глюкозы в моче можно определять также гексокиназным методом с использованием готовых наборов реактивов и на анализаторе глюкозы, пригодном для определения концентрации глюкозы в моче.
Референтные пределы: < 0,5 г/сутки (< 2,78 ммоль/сутки); 1-15 мг/100 мл (0,1 -0,8 ммоль/л), (по Н.У. Тицу, 1997).
В.4 Обнаружение билирубина в моче (качественная проба Фуше)
Принцип метода: проба основана на окислении билирубина в биливердин под действием хлорного железа, входящего в реактив Фуше, с образованием сине-зеленого окрашивания.
Реактивы: 15% раствор хлорида бария, реактив Фуше (25 г трихлоруксусной кислоты растворяют в 100 мл дистиллированной воды и приливают 10 мл 10% раствора хлорного железа).
Ход определения: к 10 мл мочи прибавляют 5 мл 15% раствора хлорида бария, смешивают, фильтруют. На фильтр капают 1-2- капли реактива Фуше. В присутствии билирубина на фильтре появляется зеленоватое или сине-зеленое пятно. Щелочную мочу перед исследованием подкисляют несколькими каплями концентрированной уксусной кислоты.
В.5 Обнаружение уробилиногена в моче (качественная проба Нейбауера).
Принцип метода: проба основана на взаимодействии уробилиногена с пара-диметиламинобензальдегидом с образованием соединения красного цвета.
Реактивы: реактив Эрлиха: 2 г парадиметиламинобензальдегида растворяют в 100 мл 20% раствора соляной кислоты.
Ход определения: К 1 мл мочи добавляют 1 каплю реактива Эрлиха, отмечают время. Окрашивание мочи в красный цвет в первые 30 сек означает положительный результат (увеличение уробилиногена). Отсутствие окраски или развитие ее по истечении 60 сек свидетельствует о нормальном содержании уробилиногена.
Мешают при определении уробилиногена: билирубин, порфобилиноген, некоторые лекарственные препараты (парааминосалициловая кислота, сульфаниламиды и др.). При обнаружении билирубина его удаляют осаждением хлоридом бария и последующим фильтрованием, в фильтрате проводят пробу на уробилиноген. Чтобы различить окраску за счет уробилиногена или порфобилиногена, к смеси мочи и реактива Эрлиха прибавляют равное количество хлороформа, при наличии уробилиногена окрашивается слой хлороформа (нижний слой), при наличии порфобилиногена – верхний водный слой. Сульфаниламиды и парааминосалициловая кислота дают с реактивом Эрлиха помутнение и оранжевую окраску, уробилиноген экстрагируют петролейным или диэтиловым эфиром и пробу повторяют с эфирным экстрактом.
Библиография
1. ГОСТ Р 52905 —2007 (ИСО 15190:2003) Требования безопасности.
2. «Инструкция по мерам профилактики распространения инфекционных заболеваний при работе в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений». Москва, 1991.
3. «Правила сбора, хранения и удаления отходов лечебно-профилактических учреждений». СанПиН 2.1.1.728-99., Москва, 1999 г.
4. ГОСТ Р 53079.4-2008 Технологии лабораторные медицинские. Обеспечение качества клинических лабораторных исследований. Часть 4 Правила ведения преаналитического этапа.
5. ГОСТ Р ИСО 15189 —2006 Лаборатории медицинские. Частные требования к качеству и компетентности.
Проект стандарта подготовили:
В.В. Меньшиков, Л.М. Пименова, Н.И. Сухачева (ММА им. И.М. Сеченова); И.А. Волкова (РГМУ), И.И. Миронова (РМАПО); Г.Н. Зубрихина (РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН).
1 Традиционно сложившееся в нашей стране наименование «Анализ мочи общий» за рубежом обозначается термином «Уринализ».