Учебное пособие составлено в соответствии с программой по биохимии для студентов всех факультетов медицинских вузов. Оно предназначено для самостоятельной подготовки студентов и оптимизации их работы на практических занятиях

Вид материала

Содержание

Занятие 4 пространственная организация белковой молекулы.
Для фарм. факультета

Подобный материал:

1 2 3 4 5 6 7 8 9 ... 30

ЗАНЯТИЕ 4

ПРОСТРАНСТВЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ БЕЛКОВОЙ МОЛЕКУЛЫ.

БИОМЕДИЦИНСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ.

При воздействии различных физических и химических факторов может происходить денатурация белка. Снижается ферментативная активность биологических катализаторов, а субстраты белковой природы легче подвергаются гидролизу. Способность белка прочно связывать ионы тяжелого металла в виде нерастворимых осадков в воде используется как противоядие при отравлении солями ртути, меди, свинца и др.

Метод диализа широко применяют для очистки коллоидных растворов и растворов высокомолекулярных соединений от низкомолекулярных примесей. На принципе компенсационной диффузии основан аппарат «искусственная почка», при помощи которого можно освобождать кровь от продуктов обмена веществ и, следовательно, временно замещать функцию больной почки.

Работа 1. Высаливание.

ОБОРУДОВАНИЕ: воронки с фильтрами.

ПРИНЦИП МЕТОДА.

Высаливание – процесс осаждения белков солями щелочных и щелочно-земельных металлов (NaCl, KCl, MgSO₄, Na₂SO₄), и солями аммония (NH₄)₂SO₄. Реакция высаливания обусловлена дегидратацией макромолекул белка с одновременной нейтрализацией электрического заряда.

Глобулины, имеющие больший молекулярный вес, легче высаливаются, чем альбумины. Глобулины осаждаются в полунасыщенном, а альбумины – в насыщенном растворе сернокислого аммония.

При высаливании белок почти не теряет своих естественных свойств; он может, например, вновь проявлять свою ферментативную активность. При растворении осажденного белка в воде происходит восстановление его исходных физико-химических и биологических свойств. Метод высаливания позволяет получить белки в кристаллическом виде и разделить белковые фракции.

ХОД РАБОТЫ.

В пробирку наливают 2 мл сыворотки крови, прибавляют равный объем насыщенного раствора сернокислого аммония и перемешивают. Получается полунасыщенный раствор сернокислого аммония. Выпадает осадок белка (глобулина).

Через 30 минут отфильтровывают содержимое пробирки. В фильтрате остается другой белок – альбумин.

Для высаливания альбумина в фильтрат добавляют тонко измельченный порошок сернокислого аммония до полного насыщения, т.е. до тех пор, пока новая порция порошка останется не растворенной. В осадок выпадает альбумин. Альбумин отфильтровывают. Проверяют фильтрат на отсутствие белка с помощью биуретовой реакции.

РЕЗУЛЬТАТЫ:

Отметить положительный результат осаждения белков плюсом, а отрицательный – минусом, и результаты занести в таблицу.

Название белковых фракций	Осаждение в полунасыщенном растворе (NH₄)₂SO₄	Осаждение в насыщенном растворе (NH₄)₂SO₄

ВЫВОД:

Работа 2. Определение изоэлектрической точки казеина.

ПРИНЦИП МЕТОДА.

В изоэлектрической точке белки обладают наименьшей устойчивостью из-за потери заряда. Молекулы белка при этом агрегируют, образуя более крупные частицы, что приводит к увеличению светорассеяния (мутности) раствора.

ХОД РАБОТЫ.

В пять пробирок отмерить по 9 мл буферных растворов с определенным значением рН. Добавить по 1 мл раствора казеина. Перемешать содержимое пробирок. Через 10-15 минут оценить степень мутности во всех пробирках. Отметить пробирку с наибольшей степенью помутнения (коагуляции).

РЕЗУЛЬТАТЫ записать в таблицу:

№№ пробирок	РН буферной смеси	Объем буферной смеси (мл)	Раствор казеина (мл)	Степень мутности^{^*}
1	3.8	9	1
2	4.4	9	1
3	4.7	9	1
4	5.1	9	1
5	5.7	9	1

ВЫВОД:

Работа 3. Необратимые способы осаждения белка из раствора.

ОБОРУДОВАНИЕ: водяная баня ( 100С).

ПРИНЦИП МЕТОДА.

Осаждение белков из растворов и биологических жидкостей может быть достигнуто с помощью физических и химических агентов, вызывающих необратимую денатурацию белка с нарушением обоих факторов устойчивости молекул белка (гидратной оболочки и заряда) и выпадением белка в осадок.

ХОД РАБОТЫ.

Работа выполняется в соответствии с условиями, указанными в таблице:

№№ пробирок	Денатурирующие агенты	Порядок работы	Результаты
1	Температура (кипячение)	1 мл белка + нагревание при 100^оС 5-10 мин.
2	Ионы Pb (раствор ацетата свинца)	1 мл белка + 2-3 капли раствора ацетата свинца^{^*}
3	Концентрированные минеральные кислоты (качественная реакция на белок в моче)	1 мл конц. HNO₃ + 1 мл белка (осторожно наслоить!)^{^*}
4	Концентрированные органические кислоты	1 мл белка + 1 мл 50% трихлоруксусной кислоты (ТХУ)

ВЫВОД:

ВОПРОСЫ К ЗАНЯТИЮ:

1. Вторичная структура белка, связи ее стабилизирующие. Характеристика a-спирали и b-складчатой структуры.

2. Третичная структура, связи ее стабилизирующие. Понятие о доменах и кластерах. Мономерные белки.

3. Четвертичная структура, связи ее стабилизирующие. Олигомерные белки.

4. Фолдинг белков. Понятие о шаперонах.

5. Белок-лигандные и белок-белковые взаимодействия. Избирательность взаимодействия. Типы природных лигандов и особенности их взаимодействия с белками. Привести примеры. Роль в образовании межмолекулярных комплексов.

6. Физико–химические свойства белков. Молекулярная масса. Изоэлектрическая точка белков. Влияние рН на заряд белков.

7. Факторы устойчивости белка в растворе. Денатурация белков. Использование денатурации в лабораторных биохимических исследованиях и медицине.

Для фарм. факультета:

Методы выделения и очистки индивидуальных белков.

Blog

Содержание

ЗАНЯТИЕ 4

ПРОСТРАНСТВЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ БЕЛКОВОЙ МОЛЕКУЛЫ.

Название