Влияние возраста и физиологического состояния животных на активность ферментных систем клеток, тканей и органов 03. 03. 01 физиология 03. 01. 04 биохимия

Вид материала

Автореферат

Содержание Научные консультанты Шевелев Николай Серафимович Воробьева Светлана Владимировна 1. Общая характеристика работы Одним из основных свойств живой клетки является избирательный транспорт веществ и энергии в клетку из внешней среды Научная новизна работы. Теоретическая и практическая значимость работы. Положения, выносимые на защиту Апробация работы и публикации. Структура и объём диссертации 2. Материалы и методы исследований Таблица 1. Количество и возрастные группы исследованных животных Цыплята-бройлеры кросса «ISA» Методы исследований Морфофизиологические показатели Биохимические показатели 7. Активность АСТ и АЛТ в гомогенате определяли методом Райтмана-Френкеля (Колб и др., 1976; Кондрахин И.П. и др., 1985). Статистическая обработка. 3. Результаты собственных исследований АТФаза Мембраны ... Полное содержание

Подобный материал:

• «Физиология и этология животных» Специальность 111201. 65 Ветеринария. Пояснительная, 240.53kb.
• Методические рекомендации к написанию и оформлению рефератов по курсу «физиология, 129.81kb.
• Анатомия и физиология человека Общее знакомство с организмом человека, 174.34kb.
• Задачами физиологии и этологии животных являются, 536.54kb.
• Тема: Двигательная активность и лфк для людей пожилого возраста, 353.11kb.
• «Физиология нервной системы», 172.86kb.
• Пояснительная записка Нормальная физиология наука и учебная дисциплина о жизненных, 578.98kb.
• Влияние пренатального стресса на процессы окислительной модификации белков и активность, 202.57kb.
• Рабочая программа дисциплины «физиология» (Физиология животных), 288kb.
• Программа дисциплины «Физиология с основами анатомии», 721.8kb.

На правах рукописи


МОСЯГИН ВЛАДИМИР ВЛАДИМИРОВИЧ


ВЛИЯНИЕ ВОЗРАСТА И ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО

СОСТОЯНИЯ ЖИВОТНЫХ НА АКТИВНОСТЬ

ФЕРМЕНТНЫХ СИСТЕМ

КЛЕТОК, ТКАНЕЙ И ОРГАНОВ


03.03.01 – физиология

03.01.04 - биохимия


АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук


Москва - 2010


Работа выполнена на кафедре физиологии животных ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» (ФГОУ ВПО МГАВМиБ)


Научные консультанты:


доктор биологических наук,

профессор Максимов Владимир Ильич


доктор биологических наук,

профессор Фурман Юрий Васильевич


Официальные оппоненты:


доктор биологических наук,

профессор Шевелев Николай Серафимович


доктор биологических наук,

профессор Шапошников Андрей Александрович


доктор биологических наук,

профессор Воробьева Светлана Владимировна


Ведущая организация:

ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт физиологии, биохимии и питания животных»


Защита диссертации состоится «____» ____ 20__ г. в ____ часов на заседании совета по защите диссертаций Д 220.042.04 при ФГОУ ВПО МГАВМиБ (109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, 23, тел. 377-93-83).


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО МГАВМиБ.


Автореферат разослан «__» _____ 20__ г.


Ученый секретарь

диссертационного совета Фомина В.Д.


1. Общая характеристика работы


Актуальность работы. В настоящее время все более очевидной становиться важная и многообразная роль ферментных систем среди различных факторов, участвующих в регуляции и интеграции процессов развития и жизненных отправлений организма. На механизмах, основу которых составляют ферментные системы, базируется раскрытие в онтогенезе путей реализации наследственной информации, регуляции роста и развития, гомеостаза (Свечин К.Б, Аршавский И.А., Квасницкий А.В. и соавт., 1967; Никитин В.Н., 1975; Лысов В.Ф., 1977, 1996, 2004; Кузнецов А.И., 1986; Максимов В.И., 1999-2002, 2004, 2005; Максимов В.И. и др., 1999-2010; Гудин В.А., 2006; Torronteras S.R.et al., 1993). В частности, характерные периоды более быстрого и замедленного роста и развития органов и организма в целом в определенной степени связаны с активностью ферментных систем.

Известно, что активность этих систем зависит от степени воздействия различных факторов внешней и внутренней среды клетки, таких как изменение рН, концентрации субстрата, химическая модификация молекул, наличие специфических активаторов и ингибиторов, изменения проницаемости мембран, скорости деградации молекул фермента, индукции и репрессии биосинтеза белка молекул ферментов и др. (Чернов Н.Н., 1996; Болдырев А.А., 1997). Степень влияния этих факторов во многом определяется экзогенными и эндогенными условиями существования, оказывающими воздействие на организм, к ним относят: возраст, тип кормления, состояние гормонального фона, физиологическое состояние, периодов репродуктивной деятельности животных, стресс, нарушения метаболизма и др. Таким образом, активность ферментов, играет ведущую роль в реализации механизмов биохимической адаптации, обеспечивающих существование организма в постоянно изменяющейся внешней среде (А.М. Мороз, 1984; A.C. Swann, 1985 и др.; М.Н. Маслова и др, 1991; И.И. Мавров и др., 2002; Е.А. Силиванова, 2006; Д.Н. Кыров, 2006 и др.; Максимов В.И., 2002, 2006, 2008).

Одним из основных свойств живой клетки является избирательный транспорт веществ и энергии в клетку из внешней среды, ведущую роль в которых играет активный транспорт, осуществляемый ферментными системами мембран (ионными насосами), интегральными компонентами которых являются АТФазы. АТФ-зависимые ионные насосы, представляющие комплекс ферментов, обеспечивают как первичный транспорт катионов (H^+, Na^+, K^+, Ca²⁺⁾ и анионов (Cl^-, HCO₃^-₎ против их электрохимических градиентов, так и вторично-активный перенос через мембрану в клетку сахаров, аминокислот, органических кислот, за счет энергии трансмембранного градиента концентрации ионов Na⁺. С работой АТФаз так же связана генерация биотоков, трансмембранного потенциала и передача нервного импульса, процессы сопряжения окислительного фосфорилирования. Накоплено большое количество сведений по изучению транспорта ионов и функционированию Mg²⁺- , Ca²⁺- , Na⁺,K⁺- , H⁺–АТФаз (Кагава Я., 1985; Болдырев А.А. и др., 1985, 1998; Вишняков С.И., 1989; Skou J.C. et al., 1992; Скулачев В.П., 1989, 2001; Опритов В.А., 1996; Цвилиховский М.И., 1997; Владимиров Ю.А., 1998; Чизмаджеев Ю.А., 2000, Лопина О.Д., 1997, 1999, 2001; Schiener-Bobis G., 2002; Jorgensen P.L. et al.,2003; Рубцов А.М., 2005 и др.).

Показатель активности АТФазных ионных насосов является очень чутким критерием оценки метаболического состояния организма. Для обеспечения процессов активного транспорта питательных веществ необходимы существенные затраты энергии, которые составляют до 40 % от суммарной энергии, поступившего корма. Существенное влияние на активность транспортных АТФаз оказывает обеспеченность животных белком различного качественного состава (Максимюк Н.Н., 1998; Фурман Ю.В., 2001).

Среди питательных веществ корма, влияющих на организм животных, ведущая роль принадлежит белку, он обеспечивает жизнедеятельность организма и способствует его росту. Роль белка особенно значима для организма птицы. В отличие от других животных птица нуждается в постоянном поступлении в организм большого количества полноценного белка. Более интенсивный обмен веществ в расчете на единицу массы тела птицы определяет и ее более высокую продуктивность. Известно, что 80 % протеина в рационах птицы приходится на долю растительных кормов, однако они имеют дефицит по ряду аминокислот и нуждаются в обогащении ими. Недостаток или избыток (имбаланс) аминокислот в рационе сопровождается нарушением обмена веществ, значительными потерями продуктивности, перерасходом кормов, снижением жизнеспособности организма, рентабельности производства в целом (Архипов А.В., 1984, 2007; Лемешева М., 2006).

Дальнейший прогресс птицеводства во многом зависит от использования новых ресурсосберегающих технологий. Это в свою очередь связано с решением проблемы дефицита кормового протеина и аминокислот за счет расширения их производства и повышения эффективности их использования (Фисинин В., 2006, 2007, Гальперн И.Л., 2009). Эту проблему в значительной степени можно решить за счет рационального использования отходов кожевенной промышленности. На предприятиях легкой промышленности их накапливается большое количество, они не только не используются, но и являются источником загрязнения окружающей среды. Производство белковых кормовых добавок из этих отходов является перспективным направлением рационального использования вторичных ресурсов (Фурман Ю.В., 2001;Бикташев Р.У., 1985).

Активность транспортных АТфаз в значительной степени зависит от изменения состава внутренней среды клетки, наблюдаемой во многих патологических процессах и в частности при воспалительных заболеваниях, что часто наблюдается у свиней (Орлянкин Б.Г., 2009; Straw B.E., 2006; Кабанов В.Д., 2001, Мисайлов В.Д., 2000).

Известно, что в воспалительный процесс вовлекаются многие биохимические компоненты, и в первую очередь ферментные системы. При повреждении клеточных мембран тканей в стадии альтерации в формирующемся очаге воспалительного процесса отмечается резкое снижение энергетических процессов и уменьшением количество ресинтезированного АТФ, вследствие реакции сосудов и развития ишемии. Это свою очередь оказывает существенное влияние на все энергозависимые процессы в клетке и ее органоидах. Нарушение структуры мембран приводит к нарушению механизмов транспорт ионов и метаболитов, накапливаются промежуточные метаболиты, отмечается распад сложных органических соединений на более простые. В результате физико-химические характеристики тканей очага воспаления резко изменяются. Повышается осмотическое и онкотическое давление, вследствие накопления одновалентных ионов (Cl^-, Na⁺, H⁺, K⁺) при одновременном уменьшении Ca²⁺, Mn²⁺, Mg²⁺, что лежит в основе развития в последующем механизмов экссудации. Повышению проницаемости биологических мембран приводит к выравниванию градиента концентрации ионов и выходу содержимого клеточных органоидов наружу. Особое значение в развитии воспалительного процесса, на стадии альтерации, играют лизосомы, содержащие большое число гидролитических ферментов, выход которых в цитоплазму приводит к лизису клетки и близлежащих тканей (Протасова Т.Н., 1975; Серов В.В. и Пауков В.С., 1995).

Анализируя все вышесказанное, следует отметить, вместе с тем, что еще нет сведений об особенностях влияния возраста и физиологического состояния в конкретные фазы постнатального онтогенеза на активность ферментных систем клеток органов и тканей различных видов животных. Нет данных по такому важному вопросу, как изменение активности ферментных систем клеток тканей и органов при действии чрезвычайных факторов среды, приводящих к развитию воспалительного процесса. При этом такие факторы могут быть эндогенного и экзогенного характера, патогенетические, предрасполагающие и сопутствующие. К ним относят различные физические, химические и биологические воздействия, приводящие к развитию стресса, нарушению обмена веществ, токсикоамз, метаболической иммунодепрессии, технопатий, эндокринных заболеваний, послеродовых и других органопатологий (Плященко С.И. и др, 1983, 1988; Онегов А.П. и др., 1984; Юрков В.М., 1988; Ярилин А.А., 1989; Жаров А.В., 1998; Идрисов Г.З., 1998; Хаитов Р.М., 2000; Кармолиев Р.Х., 2002, 2005; Галактионов В.Г., 2005; Mafayer J.R. et al., 1987).

В связи с этим вполне очевидна актуальность исследования активности ферментных систем клеток тканей и органов в постнатальном онтогенезе у птиц и свиней в зависимости от физиологического состояния и действия чрезвычайных факторов среды.

Цель работы - выявление особенностей становления физиолого-биохимических процессов и функций в организме разных видов животных в постнатальном онтогенезе, связанных с активностью ферментных систем их клеток тканей и органов в зависимости от физиологического состояния, кормления и влияния чрезвычайных факторов среды.

Для достижения цели, были поставлены следующие задачи:

1. Установление видовых особенностей функционирования АТФазных ферментных систем клеток, тканей и органов птиц и свиней.

2. Выявление активности ферментных систем (АТФаз) в ядерных и цитоплазматических мембранах эритроцитов цыплят-бройлеров, специфичности влияние ионного состава среды инкубации и ингибиторов на её активность.

3. Исследование особенности функционирования ферментных систем (АТФаз) в ядерной и цитоплазматической мембранах эритроцитов цыплят бройлеров в зависимости от возраста, а так же скармливания пептидной кормовой добавки из отходов кожевенного производства (ПКД) и сукцината натрия.

4. Выявление активности ферментных систем (АТФаз) в клетках тканей и органов цыплят-бройлеров в зависимости от возраста и скармливания ПКД.

5. Исследование активности ферментных систем клеток (АТФаз, протеаз, аминотрансфераз, фосфатаз и рибонуклеаз) в зависимости от физиологического состояния половой системы свиноматок.

6. Изучение активности ферментных систем клеток (АТФаз, протеаз, аминотрансфераз, фосфатаз и рибонуклеаз) в зависимости от действия чрезвычайных факторов, приводящих к развитию воспалительных процессов половой системы свиноматок.

7. Выявление локализации ферментных систем (АТФаз, фосфатаз) клеток эндометрия свиноматок в зависимости от влияния чрезвычайных факторов среды.

8. Исследование содержания нуклеиновых кислот в клетках эндометрия свиноматок в зависимости от физиологического состояния и действия чрезвычайных факторов среды.

Научная новизна работы. Впервые установлена видовая особенность активности ферментных систем клеток тканей и органов, которая имеет свое своеобразие у птиц и свиней.

В ядерных и цитоплазматических мембранах эритроцитов цыплят-бройлеров выявлены АТФазы, активируемые ионами Mg²⁺-, Na⁺, K⁺-, Ca²⁺- и HCO₃^-. АТФазы цитоплазматических и ядерных мембран эритроцитов цыплят имеют существенные различия, проявляющиеся во влиянии на них ионов Na⁺ и K⁺. Так, ионы Na⁺,K⁺ детерминируют АТФазную активность цитоплазматических мембран на 97%, ионы Ca²⁺ - на 87% и HCO₃^- анион - на 96% с высокой степенью достоверности. Активность АТФазы ядер не зависела от наличия в среде инкубации ионов Na⁺,K⁺ и Ca²⁺ (P>0,05) и была детерминирована ионами HCO₃^- на 96% (P<0,01).

У цыплят-бройлеров выявлена АТФазная активность и особенности функционирования в ядерных и цитоплазматических мембранах эритроцитов Mg²⁺-, Na⁺, K⁺-; Ca²⁺- и HCO₃^-- АТФаз при обычном кормлении и на рационах, содержащих сукцинат натрия и протеиновую кормовую добавку из отходов кожевенного производства. Применение сукцината и протеиновой кормовой добавки из отходов кожевенного производства способствует усилению обменных процессов в организме цыплят-бройлеров, отражающихся на активности АТФаз мембранных структур эритроцитов и показателях продуктивности.

У свиноматок выявлена функциональная активность Mg²⁺-, Na⁺, K⁺-, Ca²⁺- и HCO₃^–- АТФаз ядер, митохондрий и лизосом клеток эндометрия свиноматок в период различных стадий полового цикла, а также при наличии острого и хронического воспаления. При этом установлено:

- что активность изучаемых АТФаз изменяется в зависимости от половой цикличности и характера воспалительного процесса в эндометрии;

- наличие взаимосвязи активности АТФаз и протеаз, аминотрансфераз и фосфатаз клеток эндометрия свиноматок в динамике полового цикла, а также при наличии острого катарального эндометрита;

- зависимость ферментативной активности протеаз, аминотрансфераз и фосфатаз от их локализации, стадии полового цикла и рН среды;

- изменение активности протеаз, аминотрансфераз и фосфатаз, отражающееся на активности АТФаз ядер, митохондрий и лизосом клеток эндометрия свиноматок при остром катаральном эндометрите.

Получены новые данные о содержании и распределении в тканях эндометрия свиноматок ДНК и РНК в различные стадии полового цикла и при остром послеродовом эндометрите. Установлено, что скорость аутолиза нуклеиновых кислот в эндометрии свиноматок изменяется в зависимости от стадии полового цикла и наличия воспалительного процесса.

Теоретическая и практическая значимость работы. Выполненные исследования носят фундаментальный характер и содержат новые решения актуальной научной проблемы выяснения становления физиолого-биохимических механизмов активного транспорта ионов.

Установленные особенности физиолого-биохимических механизмов активного транспорта с участием АТФазных ионных насосов с возрастом, кормлением, физиологическим состоянием необходимы для решения практических задач по созданию нормальных условий содержания животных, обеспечивающих полное проявление их генетических потенциальных возможностей.

Результаты проведенных исследований расширяют и конкретизируют существующие представления о взаимосвязи ферментных систем в эндометрии при физиологических перестройках, связанных с половой цикличностью, а так же при развитии острого и хронического воспалительных процессов.

Полученные данные открывают перспективу для дальнейших исследований по раскрытию молекулярных механизмов функционирования АТФазных транспортных систем в субклеточных структурах клеток органов и тканей животных при изменении внешних и внутренних условий существования. Результаты работы предполагают целенаправленный поиск специфических препаратов, способных эффективно регулировать транспортные процессы. Проведенные биохимические исследования вносят несомненный вклад в решение фундаментальной проблемы регуляции активного транспорта веществ с участием АТФазных ионных насосов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Существует видовая особенность активности АТФазных ферментных систем клеток тканей и органов.

2. Физиолого-биохимические механизмы активного транспорта ионов с участием Mg²⁺-; Na⁺,K⁺-; Ca²⁺- и HCO₃^-- АТФаз в организме птиц имеют возрастные особенности.

3. Кормовые добавки (пептидная и сукцинат натрия) оказывают стимулирующее влияние на активность АТФаз, физиолого-биохимические показатели крови, тканей и органов и продуктивность цыплят-бройлеров.

4. Чрезвычайный фактор, вызвавший эндометрит изменяет физиолого-биохимические механизмы активного транспорта с участием Mg²⁺-; Na⁺,K⁺-; Ca²⁺- и HCO₃^—АТФаз субклеточных органоидов эндометрия свиноматок.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертационной работы доложены и одобрены на: Международной научно-производственной конференции по акушерству, гинекологии и биотехнологии репродукции животных (С.-Петербург, 2001); VI международной научно-производственной конференции «Проблемы сельскохозяйственного производства на современном этапе и пути их решения» (Белгород, 2002); Международной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Аграрная наука в начале XXI века» (Воронеж, 2002); VII международной научно-производственной конференции БГСХА «Проблемы сельскохозяйственного производства на современном этапе и пути их решения» (Белгород, 2003); XV международной научно-практической конференции, посвященной 300-летию С.-Петербурга «Новые фармакологические средства в ветеринарии» (С.-Петербург, 2003); Международной научно-практической конференции Курского института социального образования (филиала) РГСУ «Теоретические и прикладные проблемы социально-правовых, медико-биологических, технико-экономических сфер жизни общества» (Курск, 2007); Международной научно-практической конференции Курского института социального образования (филиала) РГСУ «Научные исследования, автоматика и динамика машин, инновационные и средозащитные технологии в техносфере» (Курск, 2007); Конференциях профессорско-преподавательского состава Курской государственной сельскохозяйственной академии имени И.И. Иванова (Курск, 1995-2005); VIII международном симпозиуме «Биологические механизмы старения» (Украина, Харьков, 2008); Всеукраинской научной конференции с международным участием «Актуальные проблемы современной биохимии и клеточной биологии» (Украина, Днепропетровск, 2008); II съезде физиологов СНГ (Кишинев, 2008); 74-й научной конференции Курского государственного медицинского университета, сессии Центрально-Черноземного научного центра РАМН и отделения РАЕН (Курск, 2009); Всеукраинской научно-практической конференции «Досягнения перспективи експерементальноi i клiнiчноi бiохiмii» (Украина. Тернополь, 2009); Всероссийской научной конференции с международным участием «Теоретические основы физической культуры» (Казань, ТГГПУ, 2009); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины», посвященной 90-летию ФГОУ ВПО МГАВМиБ (Москва, 2009); Международной научно-практической конференции «Адаптация и становление физиологических функций у животных», посвященной 90-летию кафедры физиологии животных ФГОУ ВПО МГАВМиБ (Москва, 2010); межкафедральном совещании по предварительной экспертизе диссертации в ФГОУ ВПО МГАВМиБ.

По материалам диссертации опубликованы 52 работы, в том числе: 3 -патента на полезную модель, 11 - в рецензируемых печатных изданиях, рекомендованных ВАК РФ. В публикациях содержится полный объём информации, касающийся темы диссертации.

Основные материалы, изложенные в диссертации, получены автором самостоятельно.

Выражаю научным консультантам и своим коллегам глубокую благодарность и признательность за оказанную помощь.

Структура и объём диссертации

Диссертация изложена на 246 страницах машинописного текста, иллюстрирована 40 таблицами и 79 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования (1 глава), изложения собственных результатов (6 глав), заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 359 источника, в том числе 228 отечественных и 131 иностранных.

2. Материалы и методы исследований

Исследования проведены в 1992…2010 г.г. и выполнялись в научно-исследовательских лабораториях кафедры физиологии животных ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина», в биохимическом отделе ТМО № 6 г. Курска, на животных птицефабрики «Курская» Курского района Курской области, птицефабрики «Красная поляна» Железногорского района Курской области, ООО «Курские мясопродукты», подсобного хозяйства Курской АЭС.

Объем исследований представлен в таблице 1, общая схема исследований – на рисунке 1.


Таблица 1. Количество и возрастные группы исследованных животных

Возраст	Количество, голов	Средняя масса тела
Цыплята-бройлеры кросса «ISA»
1 сут	50	46,3±0,7 г
10 сут	40	271±11 г
20 сут	40	774±31
30 сут	40	1157±68 г
40 сут	40	2125±109 г
Свиньи крупной белой породы
2 мес.	10	18-19 кг
6 мес.	10	75-85 кг
12 мес.	10	110-120 кг
Здоровые свиноматки крупной белой породы
2 года	21	170-180 кг
Свиноматки крупной белой породы с острым эндометритом
2 года	21	170-180 кг
Свиноматки крупной белой породы с хроническим эндометритом
2 года	21	170-180 кг

Рис.1. Схема исследований


Материалы исследований. Для решения поставленных задач проведено:

1. Исследование влияния кормовых добавок на четырех группах цыплят. Из суточных цыплят живой массой 37–40 грамм были сформированы четыре группы по 100 голов в каждой: три группы опытные и одна – контрольная.

Кормление экспериментальных цыплят проводили комбикормами с пониженным уровнем протеина, в 100 г которых содержалось 18–20 % сырого протеина и 295–310 ккал обменной энергии. Для доведения уровня протеина в комбикорме до рекомендуемых норм использовали протеиновую кормовую добавку из отходов кожевенного производства (опытные группы 1 и 2), мясокостную муку и сухое обезжиренное молоко (опытные группы 3 и 4), содержание в кормосмесях опытных и контрольной групп сырого протеина, кальция и фосфора существенно не отличалось (P>0,05).

В течение периода постановки опыта (40 суток) оценивали общее клиническое состояние и поведение птицы. Отмечено, что скармливание препаратов в указанных дозах не вызывает видимых изменений в поведении и клиническом состоянии цыплят.

Норма кормления соответствовала рекомендации ВИЖа (А.П. Калашников, В.И. Фисинин, В.В. Щеглов, Н.И. Клейменов, 2003).

Во время опытов осуществляли контроль за состоянием здоровья животных, вели наблюдение за приемом и поедаемостью корма, учитывали их реакцию на различные внешние раздражители.

Кровь для исследований брали у цыплят в 1, 10, 20, 30 и 40 суточном возрасте из вен шеи после умерщвления декапитацией. Отделение эритроцитов от плазмы проводили путем центрифугирования в рефрижераторной центрифуге (t=10⁰C) в течение 30 мин при 3000 оборотах. Эритроциты после отделения от плазмы двукратно отмывали физиологическим раствором.

Печень, почки, фрагменты скелетной мускулатуры и сердце брали у цыплят в 10, 20, 30 и 40 суточном возрасте.

2. Изучение активности ферментных систем эндометрия свиноматок в зависимости от состояния здоровья и стадии полового цикла. Животных разделяли на группы в зависимости от состояния здоровья и стадии полового цикла. Стадии полового цикла определяли по функциональному состоянию яичников и на основании гистологического анализа. Характер воспалительного процесса устанавливали на основании гистологических исследований эндометрия.

Фрагменты эндометрия брались из разных участков рога матки свиноматок непосредственно во время убоя для биохимического, гистологического и гистохимического анализа.

Методы исследований. Физиологическое состояние свиней и птиц, в зависимости от возраста, оценивали общепринятыми в клинической практике методами – определение температуры тела, частоты пульса и дыхательных движений в минуту, массы тела и ее среднесуточный прирост, состояния кожи, волосяного покрова, слизистых оболочек, выделений (В.Ф. Лысов, 1977, 2004, А.И. Кузнецов, 2003; и др.).

Для определения морфофизиологических, биохимических показателей, брали кровь из хвостовой артерии свиней от 10 животных в каждой группе. Кровь стабилизировали гепарином. У птиц - методом декапитации, а в более старшем возрасте – из подкрыльцовой вены от 10 животных в каждой группе. Кровь стабилизировали средой Алсвера.


Морфофизиологические показатели. В крови определяли скорость оседания эритроцитов (СОЭ) методом Панченкова. Определение гемоглобина – гемоглобин-цианидным колориметриическим методом (Симонян Г.А, 1995; Петров А.М. и др., 1995, 1999). Подсчет эритроцитов и лейкоцитов в камере Горяева и автоматическим кондуктометрическим счетчиком «Пикоскель-PS-4» (Лысов В.Ф. и др., 2004). Отдельных форм лейкоцитов (лейкограмму)  общепринятыми методами (Кондрахин И.П., 1985; Симонян Г.А. идр., 1995). В сыворотке крови исследовали содержание общего белка на рефрактометре ИРФ-22, концентрацию общего кальция, неорганического фосфора, глюкозы, АЛТ, АСТ устанавливали с использованием наборов «Био-Ла-Тест» фирмы «Лахема» с последующим спектрофотометрированием, фракции белка методом электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы, аминокислотный состав мышечной ткани – автоматическим анализатором ААА 339М (Микротехна Прага).

Биохимические показатели.

1. Субклеточные фракции (ядра, митохондрии, лизосомы) выделяли методом дифференциального центрифугирования с последующим двухкратным промыванием каждой фракции в 50 - мМ трисHCl буфере (рН 7,4) по методике Chauveau J. et al.(1956).

2. Выделение ядер и цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят-бройлеров методом 3-х кратного замораживания-оттаивания в растворе сахарозы.

3. АТФазную активность определяли методами:

а) Keeton, K.S., 1972, при этом активность Na⁺,К⁺ - АТФазы рассчитывали по разности между общей АТФазой и уабаиннечувствительной АТФазой.

б) Иващенко А.Т. и др.,1981. при этом активность АТФаз оценивали по приросту неорганического фосфата после инкубации при 37⁰С и выражали в наномолях неорганического фосфата (Фн) отщепленного 1 мг белка в 1 мин.

4. Неорганический фосфат определяли спектрофотометрическим методом (Кондрашова М.Н. и др., 1965) при длине волны 390нм, а также по методу Чена (1957) в модификации Казеннова А.М. и соавт. (1984).

5. Определение активности протеолитических ферментов в гомогенате и субклеточных фракциях проводили модифицированным методом Ансона М.Л. (Anson M.L., 1938).

6. Концентрацию белка в гомогенате и субклеточных фракциях определяли методом Lowry et al (1951), а также методом Варбурга и Кристиана (Досон Р., 1991).